淫羊藿多糖对寒凝血瘀大鼠肝脏基因表达的影响

摘要：目的归纳大鼠寒凝血瘀模型在基因表达层面的肝脏功能变化和潜在的分子标记，并探讨淫羊藿多糖（EFPS）对基因表达的影响。方法雄性SD大鼠随机分为3组：对照组、模型组和EFPS（38.7 mg/kg）组，将模型组和EFPS组大鼠连续15 d每天14∶00时置于冰水浴1 h，造模的同时每天给药1次。取3组大鼠肝脏进行转录组测序，通过构建差异表达基因（DEGs）的基因本体（GO）中生物过程（BP）与京都基因和基因组百科全书（KEGG）网络，同时结合基因富集分析（GSEA），分别分析并比对各组大鼠的肝脏功能变化。结果与对照组比较，模型组大鼠肝脏基因表达变化表现为脂质代谢下调、细胞生长受负向调控、产生免疫反应以及对于温度的自稳态调节；与模型组比较，EFPS组大鼠肝脏基因表达变化表现出免疫回调、激素调控和基因表达调控发生改变。通过二者DEGs的等量共表达模式初步确立EFPS干预寒凝血瘀模型的分子标记为Ccl5、Cxcl13、Jund。结论长期冰冷导致的体寒通过大鼠肝脏表现出脂质代谢下调、细胞生长减缓、促进炎症反应，EFPS发挥免疫和激素调节作用。

寒凝血瘀是中医学证候中常见的病证，多由寒邪侵袭机体而引起体内血行不畅、血脉不通、血液瘀滞等病理变化［1］。目前体寒模型的创建主要以生理指标为参照（如大鼠掌心温度、代谢激素水平等［2］），而从基因水平探讨中医寒凝血瘀模型的生物学内涵研究较少。

多糖及其缀合物被认为是生物体内除核酸以外的又一类重要的信息分子。由于它们常是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息的传递和感受的关键因子，因此具有生物活性的多糖研究日益受到重视［3］。淫羊藿多糖（Epimedii Foliumpolysaccharide，EFPS）是小檗科植物淫羊藿的主要活性成分之一。药理学研究显示，EFPS具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、延缓衰老等多种作用［4］。经本课题组前期研究［5］发现，相较于淫羊藿其他拆分组分，EFPS对寒凝血瘀模型物质能量代谢的下降具有更显著的回调作用；而转录组学结果显示，作用于寒凝血瘀模型时EFPS与淫羊藿全成分共有差异表达基因（DEGs）相对其他组分最多，说明EFPS可能通过作用于共同靶基因发挥与淫羊藿相似的药效。为进一步深入研究寒凝血瘀的本质以及EFPS对于寒证的药效，本研究在基因表达层面归纳了大鼠寒凝血瘀模型肝脏功能变化，并探讨EFPS对此模型的药理作用及机制。

1材料

1.1实验动物

30只雄性SD大鼠，SPF级，体质量（220±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（黑）2013-2014。保持饲养环境温度22 ℃，相对湿度40%左右，8∶00到20∶00人工灯光照明，标准大鼠饲料喂养，自由饮水，在代谢笼中适应1周后用于实验。本实验通过动物保护委员会的伦理批准，批准文号为20190921。

1.2实验药物与主要试剂

淫羊藿药材购自世一堂中药材有限公司，批号130916，产地甘肃，经黑龙江中医药大学中药资源学教研室王振月教授鉴定为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomuMaxim.的干燥叶，符合2020年版《中国药典》规定。EFPS的制备过程参照课题组前期研究［5］，淫羊藿生药材加15倍量蒸馏水回流提取2次，每次1 h，合并2煎药液，减压浓缩至稠浸膏，加入2倍量体积95%乙醇，不断搅动，静置隔夜后抽滤，沉淀为EFPS，提取率为4.3%。参考文献［6］方法测得EFPS含糖量为36.7%。

2100生物芯片分析系统检测试剂（批号5067-1511）、安捷伦高灵敏度DNA试剂盒（批号5067-4626），均购自安捷伦科技有限公司；Quant-iT PicoGreendsDNA检测试剂盒（中国赛默飞世尔科技有限公司，批号P7589）；microTUBEAFA fiber Snap-Cap（批号520045）；TruSeq NanoDNA LT Sample Prep Kit-Set A/B（批号FC-121-4001/2）；TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit-Set A/B（批号RS-122-2101/2）；Agencourt AMPure XP Beads（批号A63881）；NextSeqTM500 HighOutput Kit（300 cycles）（批号FC-404-1004）。

1.3主要仪器

CovarisTM超声波DNA破碎仪、Pico17微量台式离心机（中国赛默飞世尔科技有限公司）；RS232G紫外分光光度计（上海艾本德国际贸易有限公司）；UV-1000台式紫外分析仪（上海汗诺仪器有限公司）；凝胶成像系统（上海伯乐生命医学产品有限公司）；二代测序平台NextSeqTM500 High Output Kit（Illumina公司）。

2方法

2.1分组、造模和给药

30只大鼠随机分为3组：对照组、模型组和EFPS（38.7 mg/kg，根据人体等效剂量及组分出膏率确定）组，每组10只。参照已有建模方法［7-8］，将模型组和EFPS组大鼠每天14∶00时置于冰水浴1 h，连续15 d。根据本课题组前期相关研究［5，9-10］，综合多方面评价确立此模型为有效造模。造模的同时每天给药1次，给药体积为10mL/kg，对照组和模型组给予等体积蒸馏水。

2.2RNA提取与含量测定

给药后每组随机取3个肝脏样品，将50～100 mg新鲜肝脏在液氮预冷研钵中磨碎，然后加入1 mL Trizol试剂制匀浆。再加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。4 ℃、10 000×g离心15 min，把水相移到新管中，加0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。再次离心后移去上清，得胶状沉淀。用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、7 500×g离心5 min，弃上清。室温放至干燥后加50 μL无RNase水溶解，吸取1 μL，用紫外分光光度计在260、280、230 nm处检测样品吸光度（A）值，再各取RNA 300～500 ng，在135 V下进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳。

2.3cDNA文库构建与测序

经RNA含量测定确定符合建库标准后（A260/A280＞1.8，样品质量浓度≥20 ng/μL，琼脂糖电泳条带清晰单一），采用Illumina的TruSeq Stranded mRNA LT Sample PrepKit进行RNA纯化、片段化和cDNA文库构建。然后取1 μL文库，在Agilent Bioanalyzer 2100机器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库做2100质检。对合格的文库（有单一峰、无接头），在NextSeq机器上利用NextSeqTM500 HighOutput Kit进行2×150 bp的双端测序。

2.4转录组测序数据分析

2.4.1比对基因组参照基因组：Rattus_norvegicus.Rnor_6.0.dna.toplevel.fa（ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release-80/fasta/rattus_norvegicus/dna/）；分析软件：bowtie2/tophat2（http：//tophat.cbcb.umd.edu/）。

2.4.2DEGs分析经计算获得22 293个有效序列的RPKM（reads per kilo bases per millionreads）值后，运用R语言处理分析数据。先取每组RPKM 3次重复结果的平均值，去除所有低表达（RPKM＜1）基因，再利用biomaRt［11］将基因ID转换为对应的大鼠基因名，最后用edgeR［12］计算（fold change＞2、adjustP＜0.05）获得各组间DEGs。同时，将未去除低表达基因的数据进行GSEA［13］分析（gene set enrichment analysis，v4.0.2），所有参数均设为默认值，其结果与DEGs互为参照。

2.4.3基因功能网络分析运用Cytoscape（v3.5）中的ClueGO［14］（v2.5.5）分析DEGs所显著参与的基因本体（GO）中生物过程（BP）与京都基因和基因组百科全书（KEGG）网络。设定参数时，数据库选择without IEA，统计方法选择BH，P＜0.05。归纳DEGs功能并分析主要参与其中的基因，同时与GSEA所得功能分析结果比对。

3结果

3.1转录组分析结果

3.1.1DEGs分析结果对照组、模型组和EFPS组3组间两两比对，共得对照/模型（C_M）组、模型/给EFPS（M_E）组、对照/EFPS组（C_E）3组DEGs。各组DEGs异同关系如图1所示，其中C_M与M_E组均为单变量，C_E组为双变量。C_M与M_E交集有Ccl5、Cxcl13、Jund3个基因，在C_M中全部上调，在M_E中全部下调，且在C_E中均未差异表达，可见此3个基因在C_M与M_E中的等量共表达模式，即与对照组比较，Ccl5、Cxcl13、Jund3个基因在模型组中表达上调；与模型组比较，EFPS给药后等量回调。

3.1.2GSEA分析结果共3 881个基因通过富集评分。C_M组中2 619个基因表达上调，1 262个基因表达下调，经校验统计共543个基因显著差异表达；M_E组中3 138个基因表达上调，743个基因表达下调，经校验统计只有2个基因显著差异表达。

根据GOBP显著性评分结果，分别归纳两组中表达上调与下调基因集的功能。取排名前20的C_M显著上调基因功能（表1），其中9个与转录和调控相关，9个与免疫应答相关；C_M下调基因共显著参与17个功能（表2），其中14个均与脂质代谢相关。M_E组因只有2个显著DEGs，无GOBP显著性评分结果，无法进行功能分析与归纳。

3.2DEGs功能网络分析结果

3.2.1C_M组DEGs功能如图2-A所示，C_M组DEGs显著参与脂质代谢、细胞生长负向调控等功能。其中Acot1、Acot6、Oxsm、Socs6和Mid1ip1主要参与脂质代谢过程（cellular lipid metabolic process）；Ccl5、Cxcl13、Bmp3和Adipor2通过趋化因子与细胞因子介导的信号通路发挥趋化作用（cytokine-mediated signaling pathway）以及对于温度变化产生的自稳态调节作用（temperature homeostasis），并与Jund、Hrg、Rgs2、Socs6共同参与细胞生长调控（negative regulation ofcell growth）。

3.2.2M_E组DEGs功能如图2-B所示，M_E主要功能表现为对药物产生反应（response to drug）以及激素水平的调节（regulation of hormonelevels）。其中Ccl5、Cxcl13通过趋化因子与细胞因子介导的信号通路发挥趋化作用，与Jund和Cyp1a2共同参与药物反应；同时，Jund和Hes3参与了基因表达调控（negative regulation oftranscription）。

4讨论

目前针对寒凝血瘀模型的创建和研究主要以生理指标为参照［2，7-8，15-18］，而在基因水平探讨其生物学含义和发病机制的研究仍很欠缺［19-21］。本研究在前期研究的基础之上，分析了大鼠寒凝血瘀模型肝脏的差异基因表达，并同时运用DEGs提取和GSEA两种方法，增强了分析的全面性和可信度。由功能网络分析结合GSEA分析结果，总结各组DEGs功能如下。

C_M组DEGs功能网络分析与GSEA分析结果相吻合。C_M组表达下调的基因主要参与脂质代谢过程，表明大鼠寒凝血瘀模型相对于正常大鼠在肝脏的内源性脂质代谢整体下调。脂质与能量代谢密切相关，尤其在肝脏处，因此肝脏基因表达层面引发的脂质代谢减弱可视为此模型在受寒冷环境影响下能量代谢内生性减弱的一个具体表征，这与孟宪生等［22］有关研究以及本课题组前期多组学研究结果（模型的整体能量代谢减弱，以糖类和脂质代谢的下调为主要特征）［5］相符合，从基因、蛋白、代谢多方位印证了此寒凝血瘀模型在能量代谢方面对全身性寒冷胁迫做出的生理反应；C_M组另一显著功能变化为细胞生长负向调控和免疫应答，显示出大鼠寒凝血瘀模型较对照组生长减缓，并产生炎症反应与免疫系统应激，与王学江等［23］实验观察相符；其中Ccl5、Cxcl13表达的上调是此免疫应答的核心表现，Ccl5与Cxcl13皆为趋化因子家族成员，主要参与机体免疫应答过程，其在肝脏处表达上调可作为炎症反应的标志［24］。趋化因子家族数量庞大，而结果显示仅其中的Ccl5与Cxcl13显著差异表达，印证了二者是此模型肝脏处的免疫分子标记；本研究经分析还发现模型组DEGs参与了对于温度的自稳态调节，且未表现出激素调控的功能，表明15 d间歇性寒冷造模导致大鼠已适应冰水浴环境，与赵珊珊等［15］的研究结果完全一致，因此是基因表达层面稳定的大鼠寒凝血瘀模型，可用于后续分析和实验。

M_E组中Ccl5、Cxcl13、Jund、Cyp1a2参与药物反应及激素调节。其中，Ccl5、Cxcl13、Jund表达下调，且相对于C_M组等量回调，表明EFPS对此寒凝血瘀模型产生药效，起到免疫回调和激素水平调节的作用。以往研究［4］多关注EFPS对机体的免疫增强作用，而本课题组前期有关研究［25-26］发现淫羊藿多糖组和水段组相比其他拆分组分具有显著且多方面的双向免疫调节作用，本研究印证了EFPS的免疫回调保护作用；而激素调节方面的研究多见于淫羊藿，未见EFPS直接激素调节作用的报道，本研究首次发现EFPS可通过基因表达调控发挥激素调节的作用。通过对大鼠寒凝血瘀模型给药后肝脏基因表达变化的分析，本研究不仅印证了EFPS免疫调节的功能，并进一步在基因表达层面解释了其对于寒凝血瘀模型的作用机理。同时，经功能网络分析及蛋白互作分析显示，Ccl5与Cxcl13有紧密关联，而Jund与二者无直接关联，表明此体寒特征的显现以及EFPS发挥作用经过了并非单一的分子通路。此外，对于脂多糖产生反应（responseto lipopolysaccharide）是EFPS组DEGs功能中显著性最高的。虽有研究报道植物提取物中可含有脂多糖［27］，但EFPS中是否含有尚不明确。脂多糖可产生和释放各种促炎性细胞因子和介质，能够引起多种疾病［28］，在肝脏处可引起氧化应激及肝损伤［29］。顾欢欢［30］研究发现EFPS和脂多糖对于体外细胞具有相似的免疫刺激作用，而至今未见EFPS肝毒性报道，可预测EFPS在大鼠肝脏引发的部分分子通路与外源脂多糖激活的通路类似。

本研究在基因表达层面研究并归纳了大鼠寒凝血瘀模型的肝脏功能变化以及EFPS对其干预作用，在能量代谢、生长调控、自稳态调节、免疫应答等多方面印证了前人或本课题组相关研究，并首次发现EFPS具有激素调节作用，充分表明寒凝血瘀体质不局限于生理表征而能够于基因层面表达，并可通过药物进行干预，有助于进一步在基因表达层面深入研究体质特征以及在基因靶点方向探索药物的体质干预。同时，本研究还根据给药前后模型组的基因表达变化分析归纳出EFPS干预大鼠寒凝血瘀模型肝脏处潜在的分子标记，即Ccl5、Cxcl13、Jund表达同时上调。欲印证它们是否可独立作为此模型肝脏处的分子标记，还应与其他器官组织进行比较，其产生机制以及EFPS发挥作用的机制也有待进一步研究确认。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来  源：赵金椽，王宇，刘树民．淫羊藿多糖对寒凝血瘀大鼠肝脏基因表达的影响  [J]. 药物评价研究, 2021, 44(9): 1862-1868 .