基于网络药理学的淫羊藿抗疲劳作用机制研究

摘要：目的利用网络药理学的方法研究淫羊藿抗疲劳的作用机制。方法利用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）获取淫羊藿的活性成分及活性成分的作用靶点；在GeneCards数据库中检索与疲劳相关的靶点；由Cytoscape 3.6.1构建活性成分-疾病-靶点网络；String数据库构建靶点蛋白互作网络；DAVID数据库对靶点基因进行基因本体（GO）富集分析及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果从淫羊藿中筛选得到9种具有抗疲劳作用的活性成分：金圣草（黄）素、山柰酚、脱水淫羊藿素、C-homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)-、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl- chromone、木犀草素、广玉兰内酯、槲皮素、8-isopentenyl-kaempferol，作用于PPARG、GABRA1、CASP3、ICAM1等31个疲劳靶点，生物功能与通路富集分析表明，淫羊藿主要涉及细胞的缺氧反应、凋亡过程的调控、一氧化氮生物合成过程的正向调节、细胞对过氧化氢的反应、血糖稳态、细胞对高氧的反应、脂质贮存负调节等生物过程，通过调节PI3K-Akt、P53、HIF-1、TNF、FoxO、ErbB、MAPK等信号通路来发挥抗疲劳作用。结论研究结果体现了淫羊藿抗疲劳多成分、多靶点、多途径的作用特点，为淫羊藿抗疲劳的进一步研究提供参考。

随着现代生活节奏的加快，很多人处于亚健康状态，生理或心理往往会出现一系列疲劳症状。调查发现，约50%以上的人会感到疲劳，其中超过30%的人明确认为受到疲劳的影响，严重降低生活质量和工作效率，作为影响人类身心健康和生活质量的重要因素，疲劳正日益受到人们的广泛关注，然而由于疲劳这一概念的复杂性，经过了一个多世纪的探索，人们对其机制仍然了解甚少[1-2]。目前，临床上常用的抗疲劳药物有咖啡因、哌甲酯、莫达非尼等，其主要通过兴奋大脑皮层发挥抗疲劳作用，作用靶点单一且多具有成瘾性，副作用较大[3]。因此，研发新型抗疲劳药物成为一个热点。我国传统的中药具有多作用靶点，低副作用的特点，逐渐成为当今研究新型抗疲劳药物的重要方向。

淫羊藿，又名仙灵脾，味甘、辛，性温，归肾、肝经，《玉楸药解》注其功效：荣筋强骨，起痿壮阳，温补肝肾，滋益精血，治阴绝不生，阳痿不举。消瘰疬，起瘫痪，益志宁神，清风明目[4-6]。现代药理对淫羊藿的研究颇多[7-10]，研究表明，淫羊藿可以通过调节大鼠体内的下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）功能异常以及精氨酸、脯氨酸代谢，进而缓解疲劳[11]；并且可与其他中药配伍共同治疗疲劳。可见其在抗疲劳方面具有较好的临床应用前景，但其作用成分及具体机制尚不完全清楚，需要进一步研究。

网络药理学是一门新兴的药理学分支学科，通过利用现代的信息手段对药物的大数据进行挖掘、分析和整理，再结合相关疾病数据汇总分析，从而构建药物作用于疾病的靶点及机制网络，具有整体性、系统性的特点，因此，特别适合于中药这种具有多组分、多靶点的药物作用机制研究[12-14]。本研究拟通过网络药理学的研究方法，探究淫羊藿抗疲劳的潜在作用机制，并筛选出淫羊藿的活性成分及其作用靶点，以期为淫羊藿抗疲劳药理作用机制的进一步研究提供新的思路和理论基础。

1方法

1.1淫羊藿活性成分的筛选

利用中药系统药理数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database andAnalysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php）检索淫羊藿的活性成分，依据TCMSP的推荐，本研究按照口服生物利用度（OB）＞30%，类药性（DL）＞0.18为筛选条件，对淫羊藿的活性成分作进一步筛选。

1.2淫羊藿活性成分靶点的筛选

以1.1项下得到的23种主要活性成分的MOL ID为筛选条件，利用TCMSP的相关靶点的检索功能（Related Targets），依次得到23种主要活性成分对应的潜在作用靶点，应用Uniprot数据库（https:// www.uniprot.org/），输入靶点名称，限定物种为人，检索得到靶点名称对应的GeneSymbol，用作后续研究。

1.3抗疲劳靶点的筛选

以fatigueanti-fatigue为关键词，在Gene Cards（https://www.genecards.org/）数据库中检索已报道的与疲劳相关的基因，去除重复基因，即可得到与疲劳相关的靶基因。

1.4活性成分-疾病-靶点网络构建

应用R语言（R version3.6.0）将淫羊藿活性成分靶点和与疲劳相关的作用靶点取交集，得到淫羊藿抗疲劳的潜在作用靶点，做韦恩图。由Cytoscape 3.6.1构建活性成分-疾病-靶点网络图。

1.5蛋白相互作用网络构建

将淫羊藿的蛋白靶点导入String数据库（https:// string-db.org/，Version 11.0），String数据库中蛋白质交互作用可信度分为3个等级，交互作用评分大于0.7为高可信度，0.4～0.7为中等可信度，0.15～0.4为低可信度[15]。本研究选择交互作用大于0.4的靶点，并隐藏游离的节点，构建淫羊藿抗疲劳靶点的蛋白互作网络。下载PNG和TSV格式文件。以TSV文件为输入文件，采用R语言计算蛋白互作网络中每个蛋白的连接节点数量，输出可视化柱状图，用以确定蛋白互作网络中的核心基因。

1.6生物功能与通路富集分析

将淫羊藿的作用靶点输入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8），对淫羊藿作用靶点进行基因本体（GO）分析以及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，保存结果。设定阈值P＜0.05，筛选排名靠前的生物过程或通路，采用R语言绘制可视化图形。

2结果

2.1淫羊藿的活性成分及其作用靶点

从TCMSP中按OB＞30%、DL＞0.18共筛选得到活性成分23种，对应靶点106个，经GeneCards检索，取相关性得分大于5的与疲劳相关的靶点710个。应用R语言将淫羊藿活性成分靶点和与疲劳相关的作用靶点取交集，韦恩图见图1，共得到潜在作用靶点31个，见表1，对应活性成分9个，分别为金圣草（黄）素（chrysoeriol）、山柰酚（kaempferol）、脱水淫羊藿素（anhydroicaritin）、C-homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)-、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone、木犀草素（luteolin）、广玉兰内酯（magnograndiolide）、槲皮素（quercetin）、8-isopentenyl-kaempferol，见表2。

2.2活性成分-疾病-靶点网络构建

使用Cytoscape构建活性成分-疾病-靶点网络图，如图2所示，共有42个节点，99条边，体现了淫羊藿抗疲劳多成分、多靶点协同作用的特性。其中菱形表示疾病，三角形表示9种活性成分，矩形表示抗疲劳作用靶点。9种活性成分中金圣草（黄）素、山柰酚、脱水淫羊藿素、C- homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3.beta.)-、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone、木犀草素、广玉兰内酯、槲皮素、8-isopentenyl- kaempferol，分别作用1、9、1、3、2、13、1、27、2个靶点，预示作用靶点较多的3个活性成分槲皮素（27个）、木犀草素（13个）、山柰酚（9个），以及对应活性成分较多的2个靶点PPARG（对应7个活性成分）、GABRA1（对应6个活性成分）可能为淫羊藿抗疲劳的关键活性成分和关键作用靶点。

2.3蛋白相互作用网络构建与分析

将淫羊藿的靶点蛋白导入String数据库，限定物种为人，选择交互作用大于0.4的靶点构建蛋白互作网络，如图3所示，节点表示靶点，边表示靶点之间的关联，边的不同颜色代表不同的证据类型，边的粗细代表不同的关联分值（combine score），边越粗，关联分值越大。蛋白互作网络中，共有31个节点，205条边，平均节点度为13.2，平均局部聚类系数为0.741。不同靶点对应的边数见图4，可见，CASP3、MAPK8、VEGFA、CCNDI、ERFR、IL6、MYC等靶点位于网络的核心位置，在蛋白互作网络中发挥关键调控作用。

2.4生物功能与通路富集分析

利用DAVID数据库，分别从生物过程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）3个水平对31个靶点进行GO富集分析，共富集到235条生物功能，按照P＜0.05的阈值过滤，3个水平分别得到134、25、12条。采用R语言按照富集的显著程度取排名靠前的条目绘制可视化条形图，见图5。KEGG共富集到62条通路，按照P＜0.05的阈值过滤，得到54条通路，筛选靠前的通路绘制气泡图，见图6。

GO分析显示，在生物过程方面，这些靶点涉及细胞对缺氧的反应（cellular response to hypoxia）、凋亡过程的调控（regulation of apoptotic process）、细胞外调节蛋白激酶ERK1和ERK2级联的正调节（positive regulation of ERK1and ERK2 cascade）、丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）级联（MAPK cascade）、对钙离子的反应（response to calcium ion）、一氧化氮生物合成过程的正向调节（positive regulation ofnitric oxide biosynthetic process）、细胞对过氧化氢的反应（cellular response to hydrogen peroxide）、血糖稳态（glucose homeostasis）、细胞对高氧的反应（cellular response to hyperoxia）、脂质贮存负调节（negative regulation of lipid storage）等生物过程。分子功能方面涉及蛋白质结合（protein binding）、酶结合（enzyme binding）、蛋白异源二聚体活性（protein heterodimer ization activity）、蛋白质同源二聚体活性（protein homodimerization activity）、转录因子结合（transcription factor binding）、泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、跨膜信号受体活性（transmembrane signaling receptor activity）、半胱氨酸型肽链内切酶活性（cysteine-typeendopeptidase activity）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、等分子功能。细胞组分方面，靶点涉及核（nucleus）、细胞质（cytoplasm）、胞浆（cytosol）、质膜（plasma membrane）、细胞外空间（extracellular space）、膜筏（membrane raft）、胞质核周区（perinuclear region of cytoplasm）、线粒体外膜（mitochondrial outer membrane）、基底外侧质膜（basolateral plasma membrane）、突触（synapse）等组分。

KEGG通路分析结果（图6）显示淫羊藿抗疲劳的靶点主要涉及PI3K-Akt信号通路（10个靶点，32%）、局灶性黏连（8个靶点，26%）、p53信号通路（6个靶点，19%）、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路（6个靶点，19%）、肿瘤坏死因子信号通路（6个靶点，19%）、甲状腺激素信号通路（6个靶点，19%）、FoxO信号通路（6个靶点，19%）、ErbB信号通路（5个靶点，16%）、MAPK信号通路（5个靶点，16%）、细胞凋亡（4个靶点，13%）、催乳素信号通路（4个靶点，13%）、细胞周期（4个靶点，13%）、肌萎缩侧索硬化（3个靶点，10%）、NOD样受体信号通路（3个靶点，10%）、VEGF信号通路（3个靶点，10%）等信号通路。

3讨论

淫羊藿属中医补阳药，具有强健筋骨、补肾壮阳、缓解疲劳等功效，其复方制剂的成药或保健品用于提高免疫力，缓解疲劳症状，具有较好的临床效果。本研究基于疾病-基因-靶点-药物的研究思路，应用网络药理学的技术，从微观的分子角度系统阐述淫羊藿抗疲劳的作用机制，对淫羊藿抗疲劳作用机制的进一步研究提供参考。

本研究筛选得到淫羊藿23个活性成分，9个成分具有潜在的抗疲劳作用。作用靶点较多的3个活性成分槲皮素（27个）、木犀草素（13个）、山柰酚（9个）；对应活性成分较多的2个靶点PPARG（对应9个活性成分）、GABRA1（对应6个活性成分）可能为淫羊藿抗疲劳的关键活性成分和作用靶点。槲皮素和木犀草素有相关文献报道其抗疲劳作用，说明本研究方法合理可行[16-18]。而山柰酚缺乏文献支持，其药效学及作用机制需进一步实验证明。

GO富集分析显示，淫羊藿抗疲劳主要涉及一氧化氮生物合成、血糖稳态、细胞氧化应激等生物过程。机体能量供应不足为疲劳产生的原因之一，线粒体几乎产生机体中绝大部分的能量，一氧化氮能促进线粒体的生物合成，以保证生物体内能量的生成及供给，从而发挥抗疲劳的作用[19]。Davis等[20]发现，槲皮素可以通过增加大脑和肌肉中线粒体的生成，进而增加小鼠运动耐力，改善运动后疲劳症状。高强度运动使能源物质（如糖元、磷酸肌酸、三磷酸腺苷等）含量下降，若得不到即时补充，血糖稳态被打破，从而引发运动性疲劳[21]。此外，剧烈运动后机体处于缺氧状态，体内蓄积大量的氧自由基，导致致疲劳产生[22]。赵新望等[23]发现当机体缺氧时，可产生大量氧自由基，而消除氧自由基则可减轻疲机体劳感。相关研究表明，木犀草素和槲皮素均可以通过减少运动后血清乳酸、尿素氮以及氧自由基的过量产生，从而降低疲劳感[24-25]。

KEGG通路富集分析显示，淫羊藿抗疲劳主要涉及PI3K-Akt、P53、HIF-1、TNF、FoxO、ErbB、MAPK、催乳素、NOD样受体、VEG等信号通路，以及局灶性黏连、细胞凋亡、肌萎缩侧索硬化等反应。Zhuang等[26]研究发现人参皂苷Rb1具有缓解老龄大鼠术后疲劳综合征的作用，其机制与PI3K/Akt通路的激活，以及下游的Nrf2核转位和抗氧化酶的诱导有关。有研究[27]用银杏叶处理经IL-1β处理过的血管内皮细胞，结果显示银杏叶提取物通过调控PI3K-Akt信号通路使PI3K蛋白表达水平上升，p-Akt磷酸化增加，进而降低下游靶蛋白caspase-3、bax的表达，提高Bcl-2蛋白的表达，最终使IL-1β处理的血管内皮细胞凋亡减少。P53是发现于1979年的肿瘤抑制基因，与人体能量产生的主要场所线粒体有着十分密切的关系，参与线粒体的能量代谢、生物发生以及活性氧稳态的调控过程。通过敲除细胞P53基因，能量的生成由有氧呼吸转向糖酵解，氧消耗减少，线粒体呼吸强度变低，乳酸水平增加[28]，乳酸水平的增加正是机体产生疲劳的重要因素之一。Morris等[29]研究发现p53的失活会使线粒体功能下降，导致机体对无氧糖酵解的更大依赖，提高乳酸水平，降低骨骼肌中线粒体密度，降低体育锻炼期间的耐力，从而产生运动型疲劳，提示淫羊藿通过作用P53，维持线粒体的正常功能，发挥抗疲劳作用。HIF-1在低氧诱导的基因表达调节中起着重要作用，在低氧条件下，HIF-1被迅速诱导并高表达，通过调控下游基因缓解和减轻机体的低氧症状，提高耐缺氧能力，发挥抗疲劳作用[30]。王林佳等[31]研究发现HIF-1α的高表达可以使小鼠骨骼肌Nrf2-ARE转录活性提高，抗氧化蛋白表达增高，以及抗氧化能力提高，小鼠耐力增强。肿瘤坏死因子（TNF）是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，张亚军等[32]报道慢性疲劳综合征动物模型的TNF-α水平往往升高，抗炎性因子水平降低，呈现高氧化应激状态。FoxO是Forkhead转录因子的O亚家族，FoxO亚家族包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4和FoxO64个主要成员，其中FoxO3a在抑制细胞增殖和促进凋亡、抵御氧化应激等方面发挥作用[33]，苏路路等[34]报道FoxO4对衰老细胞的存活起着关键性作用，短期FOXO4-DRI多肽治疗可以促进小鼠毛发生长、体力恢复和小鼠肾脏功能。ErbB受体为酪氨酸激酶受体家族，其与心功能的维持和心血管的发育相关，叶勇[35]研究发现芪苈强心胶囊能够激活ErbB受体，提示ErbB家族受体参与了芪苈强心胶囊对压力超负荷致小鼠心肌肥厚的保护。MAPK信号系统在维持机体内氧化-抗氧化的动态平衡状态以及机体对环境应激的适应中发挥着重要的作用，有研究表明黑果枸杞子通过抑制MAPK信号通路蛋白的高表达，激活运动性疲劳大鼠骨骼肌MAPK信号转导系统，诱导抗氧化酶基因表达，提高骨骼肌的氧自由基清除能力，调节机体的抗氧化应激损伤能力，从而预防和延缓氧化应激损伤及运动疲劳的发生与发展[36]。

综上所述，本研究结果显示，淫羊藿9个抗疲劳活性成分作用于疲劳的31个靶点，通过调控细胞的氧化应激、凋亡、一氧化氮生物合成、血糖稳态、脂质贮存等生物过程，以及PI3K-Akt、P53、HIF-1、TNF、FoxO、ErbB、MAPK等信号通路发挥抗疲劳作用。当然，本研究也存在一定局限性，例如通过OB、DL作为筛选条件过滤掉了大量活性成分，这些未达到筛选标准的活性成分可能也具有抗疲劳作用，另外虽然通过文献调研的方式对靶点的部分生物功能和通路进行了验证，但还有待通过基础研究和临床试验进一步确证。

参考文献（略）

来  源：罗则华，杜  倩，奚  鑫，孙  梅，宋  义，刘松青．基于网络药理学的淫羊藿抗疲劳作用机制研究 [J]. 中草药, 2020, 51(11):2997-3004.