当前位置：首页 > 皮肤科 > 基于Apriori和MIE算法分析关节炎中药制剂用药规律及核心药对的潜在作用机制

基于Apriori和MIE算法分析关节炎中药制剂用药规律及核心药对的潜在作用机制

admin4个月前 (12-16)皮肤科9

关节炎主要包括类风湿性关节炎、骨性关节炎等，是一种以疼痛、肿胀、僵硬和运动障碍为特征的退行性疾病[1]。其严重时可能会导致功能丧失，给患者及其家庭和社会带来沉重负担[2]。现代医学专注于口服或外用非甾体抗炎药、透明质酸钠等以及外科手术等方法进行治疗。关节炎属于中医学中痹病的范畴，其病机多为外感湿邪、气血瘀阻。一般遵循扶正驱邪、祛风除湿的治法[3]。

互信息熵（mutual information entropy，MIE）反映2个变量之间相关性的强弱[4]，作为一种统计模型被用于图像比对、信息处理等数据分析[5-6]。复杂网络是对事物之间内在关联的剖析，被用于解决交通、社交安全、中医药等多领域的实际问题[7-9]。中成药涉及中药种类多、信息量大。因此，基于MIE值对成方制剂中的药对进行复杂网络的构建与分析，可以有效地发现重要药对以及主治疾病。

《中国药典》2020年版（下文简称药典）作为最权威的国家药品标准，其收载的中成药类别具有广泛的代表性，临床使用较为普遍。目前尚无对其中关节炎中成药用药规律特点的研究，故本研究对药典中收载的治疗关节炎的中成药进行归纳和统计，探讨其用药规律特点，以期为临床的合理辨证使用提供参考，为进一步的新药开发提供理论依据和数据支持。研究路线如图1所示。

1数据与方法

1.1资料来源及检索策略

分别以关节炎痹症痹病痹骨关节作为关键词检索药典成方制剂和单味制剂部分，收集并整理治疗关节炎的中成药。

1.2纳入标准

根据功能与主治项的具体描述确定是否录入该处方，如检索骨会出现治疗骨折症状的处方则不进行录入。保留组方相同但剂型不同的中成药。

1.3资料提取

按1.1项下检索策略双人检索药典成方制剂和单味制剂部分，收集治疗关节炎的中成药的信息。将每种中成药的名称、中药组成等信息录入WPS Office Excel表格，建立治疗关节炎的中成药

数据库。

1.4数据规范

本研究中参照药典药材与饮片部分对中药名称进行统一及规范，若药典未收录，则参照《中华本草》《中药大辞典》等书籍。本研究保留因炮制方法或产地不同，且在药典药材与饮片中有记载的中药名称，如地黄与熟地黄川乌与制川乌草乌与制草乌等；按照《临床中药学》（第3版）[10]对中成药的组方药味进行名称规范，如盐补骨脂、补骨脂统一为补骨脂；炒白芍、酒白芍、白芍统一为白芍。

1.5数据处理方法

1.5.1数据统计方法运用WPS Office Excel软件统计纳入成方制剂中全部中药及毒性中药的使用频次、功效分类、性味归经。运用《临床中药学》（第3版）分类方法将中药按功效分类。参照药典对中药治疗关节炎的271味中药进行性味归经统计。若药典未收录，则参照《中华本草》《中药大辞典》等书籍进行补充。

1.5.2关联规则分析将全部中药规范后的数据建立二分表录入IBM SPSS Modeler 18.0软件进行关联规则分析，统计相关强度较高的中药。条件支持度为包含前项的处方数占总处方数的百分比；规则支持度指同时包含前项与后项的处方数占全部处方数的百分比；置信度为条件支持度与规则支持度的百分比，即前项出现的情况下后项出现的概率[11]。提升度用于衡量关联规则前项出现提升后项出现的程度，若提升度＞1，认为前项和后项之间有良好的相关性[12]。

1.5.3MIE分析MIE用于衡量事物与事物之间的相关性。假设2个离散随机变量为药材x与药材y，则两药材的MIE可以如下描述。MIE(x,y)值越大，则表示药对之间的联系越强。

p(x,y)是药材x与药材y同时出现在一个处方中的概率，p(x)是药材x出现在处方中概率，p(y)是药材y出现在处方中概率，m为总处方，i表示符合该情况下处方的个数

1.5.4药材配伍网络的构建与分析药对按MIE的大小进行排序，选择排名前25%的药对构建药材配伍网络。该网络以药材为节点，以药对的MIE为加权边，依据节点相互之间的关联，采用Cytoscape 3.9.1中Glay法对网络节点进行聚类分析，集群的规模为不小于5种药材[13]。

1.6网络药理学分析

通过检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和中医百科全书数据库（ETCM，http://www.tcmip.cn/ ETCM/index.php）以及查阅文献，收集当归、川芎和白芷3味中药的活性成分。在TCMSP数据库中，以口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为筛选条件，在ETCM数据库中，以定量评估类药性（quantitative estimate of drug-likeness，QED）＞0.67为筛选条件，同时结合相关文献，共同筛选出3个中药的活性成分。将活性成分合并、去重后获取对应蛋白靶点。将蛋白靶点数据输入UniProt蛋白质数据库，选择物种为人，统一名称和写法，剔除无对应基因名称的蛋白。将上述数据库所得结果合并，即获得当归-川芎药对和当归-川芎-白芷药组活性成分对应靶点数据集。在OMIM（http://www.omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和Genecards（https:// www.genecards.org/）数据库收集关节炎相关的基因靶点，建立疾病靶点数据集。运用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对交集靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并运用微生信在线作图平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化。运用Cytoscape 3.9.1软件绘制成分-靶点-通路网络图。

2结果

2.1纳入处方情况

通过检索药典，共纳入110个处方，包括102个成方制剂和8个单味制剂。

2.2中药数据分析

2.2.1中药使用频次分析治疗关节炎的110个中成药处方中，共计271味中药，其中包括毒性中药42味。对271味中药进行频次统计，结果按照降序排列，其中使用频次≥10的中药共38味，使用频次较高的为当归（37次）、红花（30次）、乳香（27次）、没药（25次）等，见表1。毒性中药使用频次较高的为制川乌（18次）、制草乌（17次）、马钱子（15次）、樟脑（15次）等，见表2。经统计，在治疗关节炎的110首中成药处方中有94首中成药处方中含有至少1味毒性中药。

2.2.2中药功效类别分析对治疗关节炎的271味中药进行功效类别统计，其中79味不常用中药（如鬼画符、阴阳枫等）因《临床中药学》（第3版）等参考书目中未收载，尚不清楚其所归属的功效类别，故在本部分统计中未计入，对余下192味中药的功效分类进行统计。中药的功效分类频次居前3的是祛风湿药、补虚药、活血化瘀药，见表3。祛风湿药多具有辛温之性，主入肝、肾经，能够祛除关节、经络等处的风寒湿邪，以此来达到舒筋、通络、通痹、止痛的作用。补虚药可补充人体气血阴阳之不足，消除机体虚弱症状。活血化瘀药可活血通络、消散阻滞、通经止痛。3类药对关节炎等痹症都可起到治疗作用[14]。

2.2.3中药归经分析治疗关节炎的271味中药中鬼画符、羊耳菊等41味中药未查到归经记载，故对余下230味中药归经进行统计，频次共2 927次，其中归经频次最高为肝经，其次为脾经、肾经、心经和肺经等，见表4。毒性中药中八角枫、四块瓦等4味中药未查到归经记载，故仅对余下38味毒性中药进行归经频次统计。38味毒性中药的归经频次共计404次，其中频次最高为肝经，其次为脾经、心经、肾经和肺经等，见表5。肝主疏泄，维持气机疏通畅达。肝血亏虚，筋骨失濡，可见肢体疼痛、屈伸受限[15]。脾主运化、统血，脾失健运，四肢肌肉失养，则会导致四肢软弱无力甚至痿废。故治疗关节炎疾病时，药物多归肝、脾经。

2.2.4中药药性分析治疗关节炎的271味中药中鬼画符等15味中药未查到药性记载，余下256味中药药性频次共计1 168次，药性频次最高为温，其次为平、微温、寒和微寒等，见表4。42味毒性中药药性频次共计157次，频次最高为热，其次为温、平、大热和寒等，见表5。温具有温通的作用，可祛邪通络，从而使瘀得通，湿邪则散[16]。

2.2.5中药药味分析治疗关节炎的271味中药中鬼画符等15味中药未查到药味记载，余下256味中药的药味频次共计1 944次，频次最高为辛，其次为苦、甘、微苦和酸等，见表4。42味毒性中药药味频次共计256次，其中频次最高为辛，其次为苦、甘、咸和微辛等，见表5。辛味药具有辛温助阳、解表祛邪、辛畅气机、辛润通络等功效[17]。

2.3毒性中药的毒性等级分类及用量

毒性中药的毒性分类及用法用量按照药典的定量分级分为大毒、有毒、小毒3类。经统计，42味毒性中药中大毒6味、小毒19味、有毒17味，其中大毒、小毒、有毒的中药使用频次最多的分别为马钱子、樟脑、制川乌。运用WPS Office Excel软件对毒性中药用量进行分析，最大用量＞500 g的毒性中药有生川乌750 g、天南星1 000 g、祖师麻1100 g、八角枫1 500 g、丁公藤2 500 g、昆明山海棠2 500 g、芫花条3 000 g、艾叶20 000 g，平均用量最大的毒性中药为艾叶，见表2。

2.4中药关联规则分析

基于IBM SPSS Modeler 18.0软件的Apriori算法，设置支持度（条件）为15.0%，置信度为50.0%，最大前项数为5，对频次≥15次的高频中药（共23味）进行关联规则分析并绘制网络图（图2），其中连线粗细表示关联程度。关联规则结果见表6、7。

结果显示，共产生44条规则，其中药对40条，3味药组4条。在药对关联规则分析中，规则支持度最高的药对是乳香-没药，为20.909%；置信度最高的药对是乳香-没药，为92%；提升度＞2的药对有32条。在3味药组关联规则分析中，规则支持度最高的是当归→乳香-没药，为10.909%；置信度最高的是白芷→川芎-当归、防风→川芎-当归、乳香→川芎-当归，为52.632%；提升度＞2的3味药组有3条。

2.5MIE分析

中药两两之间的配伍关系用MIE进行量化。271味不重复的药材形成5 187个药对，MIE控制在−0.008 2～0.120 0，排名前25%的药对共有1 297个，高MIE的药对有没药-乳香（0.120 0）、川芎-当归（0.067 4）、桂枝-防风（0.058 7）等，见表8。

2.6中药配伍网络分析

中药配伍网络由230个节点（药材），1 275条边组成。边的颜色深浅与MIE成正比，见图3。中药配伍网络的节点按Glay法可分为11个药材集群，同时对前5个集群的相关方剂的主治疾病进行统计分析，见表9。因余下的集群中所含药味未包含60%成方制剂中所含有的药味，因此未进行分析。集群分析的结果显示，关节炎相关方剂的主治疾病为风寒湿痹证，该疾病多因人体正气不足而腠理开放，易感受风寒湿邪，出现气血瘀滞，经脉不通，关节肿痛症状[18]。不同集群对应主治疾病不同。集群1主要治疗风寒湿痹、风湿瘀痛，如安阳精制膏有舒筋活血、追风散寒之效；集群中82味中药性味以辛、温为主，主归肝经。集群2主要治疗类风湿性关节炎，正虚邪实为基本病机，瘀血是病因也是病理产物[19]，如通痹片可祛风胜湿、散寒止痛；集群中38味中药性味以辛、温为主，主归肝、脾经。集群3可用于治疗风湿热痹，由感受风热湿邪，气血经脉瘀滞筋骨关节引起，因此治疗时多从清热、除湿入手[20]，如滑膜炎片用于清热祛湿、活血通络；集群中22味中药性味以苦、寒为主，主归肝经。集群4的中华跌打丸有消肿止痛、活血祛瘀之效。集群5可用于治疗风湿骨痛和风寒湿痹，如云香祛风止痛酊和钻山风糖浆均有祛风除湿、活血止痛之效。

2.7网络药理学分析

乳香和没药是临床常用相须配伍的2味药，有关乳香-没药药对的化学成分和药理作用研究较多，乳香-没药药对中的挥发油类成分是发挥抗炎作用的主要化学成分[21]，其治疗关节炎的作用机制是抗氧化、抑制破骨、抑制促炎细胞因子的表达和增加抗炎细胞因子的表达[22]，主要通路为流体剪切应力与动脉粥样硬化、晚期糖基化终末化产物-晚期糖基化受体（advanced glycation end products-advanced glycosylation end-product specific receptor，AGE-RAGE）信号通路、白细胞介素-17信号通路等[23]。当归-川芎常常配对使用，尤其多见于一些治疗妇科疾病的名方[24]。目前，当归-川芎药对和当归-川芎-白芷药组治疗关节炎的研究较少。本研究经关联规则分析与MIE分析发现，当归、川芎、白芷关联性较强，推测其为治疗关节炎的核心药味，因此对当归-川芎药对以及当归-川芎-白芷药组开展网络药理学研究。当归活性成分共12个，川芎活性成分共21个，白芷活性成分共21个，见表10。当归-川芎药对和当归-川芎-白芷药组的药物靶点均为127个，关节炎的疾病靶点1 366个。当归-川芎与关节炎交集靶点41个；当归-川芎-白芷与关节炎交集靶点41个。

2.7.1交集靶点GO功能富集与KEGG信号通路分析将当归-川芎和当归-川芎-白芷与关节炎的41个交集靶点导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析经P＜0.01筛选后，选取前10个生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和细胞组成（cellular component，CC）条目可视化，BP主要富集在单萜类代谢、长链脂肪酸生物合成、缺氧反应、对外源性刺激的反应等；CC主要富集于分泌颗粒腔、细胞质、大分子复合物、胞外区、富含ficolin-1的颗粒管腔等区域；MF主要富集在血红素结合、RNA聚合酶II转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合、类固醇结合等，见图4-A。KEGG富集分析后通路主要包含癌症相关通路、花生四烯酸代谢通路、亚油酸通路等，选取前20个KEGG通路富集分析结果进行可视化，见图4-B。

2.7.2成分-靶点-通路分析将当归-川芎的29个活性成分、41个交集靶点、KEGG排名前20的通路和当归-川芎-白芷的47个活性成分、41个交集靶点、KEGG排名前20的通路分别导入Cytoscape3.9.1软件进行分析，如图5、6所示，红色为靶点、蓝色为活性成分、绿色为通路，颜色越深、节点越大说明该成分度（degree）值越大。活性成分编号见表10。

3讨论

本研究对药典中治疗关节炎成方制剂和单味制剂中271味中药使用频次进行排序，使用频次排名前6的中药为当归、红花、乳香、没药、防风、独活。当归具有补血活血的作用，适用于血虚、血瘀兼寒凝所致诸痛，是中医药古籍中治疗痹症的核心高频用药[27]。当归-川芎药对出自宋代《太平惠民和剂局方》的芎归汤，当归偏于补血养血，川芎偏于活血行气可散邪，具有通脉除痹之效[28]。红花性味温、辛，归心、肝经，具有活血通经、散瘀止痛之效。乳香香窜，偏于行痹，宜用于风湿痹痛、筋脉拘挛；没药偏于活血化瘀，多用于瘀血较重的疼痛。对使用频次≥15的23味中药进行关联规则分析以及MIE分析可知，乳香-没药药对关联程度较高，最早在华佗《中藏经》卷下的大圣通神乳香膏中使用，外用治疗发背痈疽、诸毒疮肿。《医学衷中参西录》中有多达22首方药使用乳香-没药[29]。《本草纲目》曰：乳香活血，没药散血，皆能止痛消肿生肌。故二药每相兼用。现代药理学表明，乳香-没药药对具有明确的止痛消炎作用，乳香的三萜酸和没药的倍半萜类成分发挥主要作用，并且二者合用可以抑制血小板的聚集[30]。防风-桂枝防风-独活作为常用药对被使用，防风具有祛风、解表、胜湿、止痉之效[31]。独活善行，祛腰膝筋骨间风寒湿邪所致的下焦之病症[32]，除深伏于筋骨之间的邪气以除痹[33]。3项药组中规则支持度最高的为当归-乳香-没药。乳香、没药、川芎为活血化瘀药，防风、桂枝为解表药，独活为祛风湿药，当归为补血药，这提示在治疗关节炎使用药材方面补血药与活血化瘀药、祛风湿药和解表药之间存在较强的关联性。血为气之母，气为血之帅，使用活血药治疗气血瘀滞，补血药增补正气，气血流通，经络通畅，疼痛得以治疗；祛风湿药与解表药共用祛外邪除湿，体现关节炎疾病祛风除湿、补益气血的主要治法。

毒性中药运用历史悠久，在治疗重疾和顽疾方面发挥重要作用[34]。经统计，毒性中药主归肝经，药性以热为主，药味以辛为主。通过对药典中治疗关节炎的成方制剂中42味毒性中药的分析可见，频次排名前3依次为制川乌、制草乌、马钱子、樟脑。因马钱子易引起严重的毒性反应，临床常用马钱子炮制品，或通过配伍减毒[35]。4种毒性中药均有抗炎作用，能够在一定程度上起到治疗关节炎的作用[36-37]。对中成药治疗关节炎的42味毒性中药的毒性等级及用量统计可知，大毒药物使用较少且剂量较小。经统计可发现，在治疗关节炎的110种中成药处方中，有94种中成药处方中含有至少1味毒性中药，表明毒性中药在治疗关节炎中较为常见。

本研究采用了关联规则分析和MIE分析，Apriori算法是关联规则中的经典算法，算法简单，易于实现，被广泛用于药对关联强度分析中。由于Apriori仅针对高频中药进行分析，不能兼顾所有中药。为进一步挖掘中药配伍情况，本研究同时采用MIE分析，通过计算MIE值，得到所有药对的相关性强弱。2种方法共同使用，可以更好地挖掘常用药对，如党参-白芍狗脊-淫羊藿在关联规则结果中没有涉及，但通过MIE分析体现较高的相关性。

由网络药理学分析得到，药对当归-川芎防治关节炎的潜在活性成分包括β-谷甾醇、阿魏酸和杨梅酮等，通过调节前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、半胱氨酸蛋白水解酶3（cystathione aspartase 3，CASP3）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、PTGS1等靶点发挥作用。药组当归-川芎-白芷防治关节炎的潜在活性成分包括β-谷甾醇、阿魏酸、杨梅酮和豆甾醇等，通过调节PTGS2、PTGS1、热休克蛋白90AB1（heat shock protein 90 alpha family class B member 1，HSP90AB1）等靶点发挥作用。β-谷甾醇、豆甾醇等植物甾醇具有免疫抗炎作用[38]。β-谷甾醇可以通过抑制软骨细胞凋亡和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activeted protein kinase，MAPK）通路，减轻骨关节炎的炎症和软骨退行性病变[39]。杨梅黄酮可调节炎症因子水平，表现出抗炎活性[40-41]。有研究发现阿魏酸通过调节PTGS2、CASP3等靶点，调控癌症通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信号通路，从而抑制氧化应激反应、炎性反应、软骨细胞凋亡等来治疗关节炎[42]。研究发现，类风湿性关节炎的发病机制与铁下垂有关，并鉴定出基因PTGS2与铁下垂高度相关，当细胞发生铁下垂时，PTGS2的表达会增加[43]。HSP90AB1可在软骨保护性培养基中富集，并免疫沉淀磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。细胞外GAPDH与L1细胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1CAM）相互作用并抑制致瘤行为，而细胞内GAPDH下调p38同时发挥抗炎作用[44]。CASP3是治疗骨关节炎的关键候选靶点[36]。细胞凋亡受Bcl-2家族等多种基因的调控，在维持组织和细胞的稳态中起着关键作用[45]。李田洋等[46]通过建立膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）家兔模型探究药物对软骨细胞凋亡的调控与作用机制，发现药物能够促进Bcl-2表达，降低Bax水平，抑制KOA家兔软骨细胞的凋亡，保护关节软骨细胞，减轻KOA软骨细胞的炎症损伤[47]。

4结论

本研究通过对药典中治疗关节炎的中成药进行数据挖掘和分析，得到了中成药治疗关节炎以扶正驱邪、宣通脏腑、调达经络为主的用药规律，发现常用配伍药组为没药-乳香乳香-没药-当归等。强相关药对当归-川芎、药组当归-川芎-白芷中的潜在活性成分有β-谷甾醇、豆甾醇、杨梅酮和阿魏酸等，作用于PTGS2、HSP90AB1、CASP3、Bcl-2、Bax、PTGS1等多靶点，通过调控癌症相关通路、花生四烯酸代谢通路、亚油酸通路等多种信号通路发挥作用，为后续当归-川芎药对、当归-川芎-白芷药组治疗关节炎的作用机制研究提供了思路。