基于加权网络药理学的小柴胡汤抗肝癌作用机制研究
第12期中药复方网络药理学培训会议（线上会议）将于2021年3月27-28日召开，本次培训会将邀请长期从事网络药理学的研究人员，将结合个人实践经验，从科研设计、项目具体实施以及SCI文章发表等多个方面，通过实际案例，与广大学员共同学习探讨网络药理学在中药作用原理研究中的思路及方法。了解培训详细信息及报名直接点击文章最下方阅读原文。
时间：2021年3月5-6日
方式：腾讯会议app
时间：2021年3月27-28日
方式：线上会议（腾讯会议）
时间：2021年4月10-11日
地点：北京（具体地点见第二轮通知）
来源：《中国药物化学杂志》2020, 30 (11)
基于加权网络药理学的
小柴胡汤抗肝癌作用机制研究
翟玉萱1,2,赵怡3,项荣武1,2,
翟菲1,2,曾娅3,梁建坤1,2通信作者
(1.沈阳药科大学医疗器械学院;2.辽宁省医药大数据与人工智能工程技术研究中心;3.沈阳药科大学药学院)
肝癌是世界范围内发病率排名第三的恶性肿瘤,具有起病隐匿､病情发展快､对放化疗敏感性差､死亡率高､符合手术切除条件的患者比例很小､术后复发率高等特点｡由于肝癌涉及多基因突变,西药很难通过单一靶点作用而产生良好的疗效,而且容易产生耐药性,不良反应明显｡中药复方按照君､臣､佐､使的原则配伍,具有多成分､多靶点､多通路协同作用的特点,越来越受到人们的关注,而且和西药联合应用还能起到减毒增效的效果｡中医经典方剂小柴胡汤出自东汉张仲景的《伤寒论》,由柴胡､黄芩､人参､半夏､甘草(炙)､生姜､大枣七味中药组成,是和解少阳的代表方剂,临床试验证明其对肝癌具有显著的治疗作用｡传统的网络药理学方法从多成分-多靶点-多通路的角度阐述药物的作用机制,具有较强的整体性,与中医的系统理论相一致｡但是在网络分析中只考虑了节点间是否存在关系,而忽略了节点间联系的强弱,因此影响了分析结果的准确性｡本研究引入加权算法通过有权网络提升了分析结果的可靠性,为网络药理学分析提供了一种新的思路｡
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材料与方法
1.1化学成分的收集与筛选
利用TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)数据库检索小柴胡汤的有效活性成分,并根据口服生物利用度(OB)大于等于30%和类药性(DL)大于等于0.18进行筛选,利用文献挖掘的方法对小柴胡汤的有效活性成分进行补充和完善,构建小柴胡汤的活性成分数据库｡
1.2构建小柴胡汤的药物作用靶点集
将收集到的活性成分利用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库预测其在大于95%相似度下的靶点集,并利用TCMKD1.0(traditional Chinese medicine knowledge discovery database)对每个活性成分的预测靶点集进行肘点法筛选优化,利用UniProt(https://www.uniprot.org)数据库对优化结果进行标准化,最终得到小柴胡汤有效活性成分的药物作用靶点集(集合A)｡
1.3构建肝癌的疾病靶点集
利用OMIM(https://www.omim.org)､GeneCards(https://www.genecards.org)､DisGeNET(http://www.disgenet.org)､TTD(https://db.idrblab.org/ttd)4个数据库,收集已知的与肝癌相关的基因,经删重和剔除假阳性基因后,得到抗肝癌作用靶点集(集合B),并利用UniProt数据库进行标准化｡
1.4构建肝癌的差异表达基因集
利用GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)获取肝癌的相关基因测序和表达数据,利用Bioconductor进行预处理､合并､批次校正､探针注释､加权基因共表达网络分析(WGCNA)､构建共表达网络,得到肝癌的差异表达基因集(集合C)｡
1.5构建小柴胡汤抗肝癌靶点集
将集合B和C合并､去重,得到肝癌直接作用靶点集(集合D)｡利用STRING(https://string-db.org)数据库获取与集合D中的靶点具有直接联系的二级靶点(Combined_Score>0.9),构成肝癌间接作用靶点集(集合E)｡取集合A与集合D､E的交集,即A∩(D∪E),作为最终的小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合F)｡
1.6小柴胡汤中抗肝癌靶点的通路注释分析
利用STRING数据库对小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合F)进行GO富集分析和通路注释分析,获得小柴胡汤抗肝癌的通路和调控机制｡
1.7小柴胡汤抗肝癌的成分-靶点-通路无权网络构建
对上述得到的小柴胡汤成分以及作用的靶点和通路,利用Cytoscape3.7.1构建小柴胡汤抗肝癌的成分-靶点-通路无权重网络,并进行参数分析｡
1.8小柴胡汤的化合物-靶点-通路加权网络构建
本研究通过在传统的无向无权重网络基础上引入节点间的权重指标以提高分析结果的可靠性｡节点间权重的获取方法如下,将对活性成分进行靶点预测过程中的相似度作为化合物-靶点间的权重,将STRING数据库分析中的Combined_Score作为靶点-靶点间的权重,将RontoTools的计算结果作为靶点-通路间的权重,从而定义节点强度参数Ii､节点聚集强度参数Gi､维恩系数vi以及节点重要度参数Pi｡
其中,节点强度参数Ii为加权模式下节点的强度与其邻居节点强度的结合,如式<1>所示:
其中,Si为节点i的强度,Sj为邻居节点j的强度,计算方法如式<2>所示:
其中,ki为节点i的度值,wij为节点与邻居节点的连边权值,α和β分别为度值及连接强度的权重系数,用来调整节点度值与连接强度的重要程度｡
节点聚集强度参数Gi将加权网络节点局部的聚集参数ci与节点强度Ii相结合,综合反映节点i与邻居之间的紧密程度,计算方法如式<3>所示:
其中,ci为节点i加权后的集聚系数,计算方法如式<4>所示:
其中,wij和wki为节点与其邻居节点的连边权值,wjk为节点的邻居节点之间的连边权值｡
为不同来源的靶点节点设置相应的维恩系数,来自集合A∩B∩C(集合X)的维恩系数为1.0,来自集合A∩B(集合Y)的维恩系数为0.9,来自集合A∩C(集合Z)的维恩系数为0.8,来自集合A∩X的二级靶点的维恩系数为0.5,来自集合A∩Y的二级靶点的维恩系数为0.45,来自集合A∩Z的二级靶点的维恩系数为0.4,同时符合多种集合条件时维恩系数取最高值｡对于非靶点节点维恩系数取1.0不做调整｡
节点重要度参数Pi将节点强度､节点聚集强度､维恩系数相结合,计算方法如式<5>所示:
综合考虑每个节点的度值､邻居节点的信息､聚集程度以及靶点来源,最终得到具有每个节点重要度的加权网络,并分析得出核心靶点和核心通路｡利用Cytoscape3.7.1绘制加权分析后的化合物-靶点-通路核心网络,实现小柴胡汤抗肝癌的多成分､多靶点､多通路的协同作用机制的可视化分析｡
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研究结果
2.1有效活性成分收集
利用TCMSP数据库通过筛选条件(OB≥30%,DL≥0.18)检索得到有效活性成分216个(其中柴胡17个､黄芩36个､半夏15个､生姜5个､人参22个､大枣29个､甘草92个),去重后结果为178个｡通过文献挖掘收集到被上述OB､DL条件剔除但被证实具有显著药理活性且对肿瘤细胞具有显著抑制作用的4个化合物,分别为柴胡皂苷a､柴胡皂苷b､柴胡皂苷d和人参皂苷Rg3｡最终得到小柴胡汤的有效活性成分182个｡
2.2小柴胡汤的药物作用靶点集构建
利用PubChem数据库对182个有效活性成分进行基于配体结构特征的潜在靶点预测,利用TCMKD软件对每个有效活性成分的预测靶点通过肘点法进行筛选优化,最终得到小柴胡汤的1241个药物作用靶点集(集合A)｡
2.3已知抗肝癌作用靶点集构建
利用OMIM数据库检索得到肝癌相关靶点210个,利用GeneCards数据库检索得到186个,利用DisGeNET数据库检索得到615个,利用TTD数据库检索得到6个｡将上述4个检索结果合并､去重,最终得到已知具有抗肝癌作用的相关靶点896个(集合B)｡
2.4与肝癌高度相关的靶点集构建
本研究选取同一平台GPL570的多张基因芯片进行联合分析｡通过一体化预处理算法对原始的肝癌组织样本数据和癌旁正常组织样本数据进行预处理､合并､去除批间差异､注释探针,得到具有23494个基因的表达矩阵,构建加权基因共表达网络｡根据每个模块的模块显著性确定其与肝癌的相关度,如图1所示｡本研究选择相关性最高的red和blue模块内的基因作为肝癌高度相关的靶点集,经标准化处理得到1569个差异显著基因(集合C)｡
2.5小柴胡汤抗肝癌靶点集的建立
将已知的具有抗肝癌作用的靶点集(集合B)和与肝癌高度相关的靶点集(集合C)合并､去重,得到肝癌直接作用靶点集(集合D),共2363个靶点｡利用STRING数据库,检索与肝癌直接作用靶点集(集合D)有直接联系的二级靶点(Combined_Score>0.9),作为肝癌间接作用靶点集(集合E)｡将肝癌直接作用靶点集(集合D)与肝癌间接作用靶点集(集合E)的并集(集合D∪E)与小柴胡汤的药物作用靶点集(集合A)取交集［A∩(D∪E)］,得到小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合F),共计907个靶点｡
2.6GO富集分析和通路注释分析结果
对小柴胡汤抗肝癌靶点集(集合F)中的907个靶点通过STRING数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并以FDR<0.01作为筛选条件｡按照FDR值进行升序排列,将排名前15个条目利用R3.6.0绘制高级气泡图,分析结果分别如图2和3所示｡
小柴胡汤治疗肝癌的GO功能主要涉及催化活性､蛋白激酶活性､磷酸转移酶活性､激酶活性､小分子结合､药物结合､转移酶活性､阴离子结合､核苷酸结合､蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等｡小柴胡汤治疗肝癌的KEGG通路主要涉及癌症通路､神经活性配体-受体相互作用､MAPK信号通路､cAMP信号通路､非酒精性脂肪肝､钙信号通路､PI3K-Akt信号通路､癌症中的微核糖核酸､阿尔兹海默症､FoxO信号通路､细胞凋亡､Ras信号通路､病毒致癌等｡
2.7小柴胡汤抗肝癌的成分-靶点-通路无权网络的构建结果
利用Cytoscape3.7.1软件构建普通无权重的小柴胡汤活性成分-靶点-通路网络模型,并进行拓扑网络分析｡按照度值由大到小排序,得到NFKB1､MAPK1､RELA､TDP1､ESR1等20个排名靠前的关键靶点,pathw ays in cancer､metabolic pathw ays､neuroactive ligand-receptor interaction､MAPK signaling pathway､PI3K-Akt signaling pathway等30个排名靠前的关键通路,如图4所示｡其中节点为化合物(黄色矩形)､靶标(绿色三角形)和通路(紫色圆形),边为化合物-靶标对､靶标-靶标对､靶标-通路对｡
2.8小柴胡汤化合物-靶点-通路加权网络的构建结果
以靶点预测结果的相似度作为化合物-靶点间的权重,以PPI网络中的Combined_Score作为靶点-靶点间的权重,以RontoTools的结果作为靶点-通路间的权重,将无权的化合物-靶点-通路网络转换为有权网络｡根据有权网络中节点的度值､节点间连线的权重､节点强度､节点聚集强度､维恩系数等参数,依次计算小柴胡汤化合物-靶点-通路加权网络中每个节点的重要度参数Pi,Pi值最大的20个关键靶点如表1所示｡其中,节点的度值既包括STRING库PPI网络中靶点-靶点的连线又包括靶点-活性成分和靶点-通路的连线｡
综合考虑KEGG通路富集分析结果中的通路排名和加权网络中通路节点重要度参数排名,综合排名的前30个通路信息如表2所示,同时包含了通路富集分析结果的前15条通路和加权网络中节点重要度参数排名的前15条通路｡
利用Cytoscape3.7.1以加权网络分析结果中重要度排名前20的关键靶点､综合排名前30的通路及相关活性成分为对象,绘制小柴胡汤的成分-靶点-通路核心网络图,结果如图5所示｡其中节点为化合物(红色)､靶标(蓝色)和通路(绿色),边为化合物-靶标､靶标-靶标和靶标-通路对｡结合图4和图5发现,在小柴胡汤的182个有效活性成分中有158个活性成分至少作用于一个关键靶点,这充分体现了中药小柴胡汤通过多成分-多靶点-多通路的相互作用来达到抗肝癌效果的协同作用机制特点｡
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讨论
本研究通过纳入药物靶点､疾病靶点､GEO差异显著基因,并同时考虑小柴胡汤有效活性成分直接作用于肝癌靶点和间接作用于肝癌二级靶点的影响因素,较为客观地反映了中药多成分-多靶点-多通路协同作用的特点｡通过给成分-靶点､靶点-靶点､靶点-通路间的联系赋以适当的权重,将传统的无权网络升级为加权网络并进行加权分析,挖掘出核心靶点和核心通路,更加真实地反映了小柴胡汤抗肝癌的作用机制｡小柴胡汤抗肝癌的化合物-靶点-通路网络在加权前后关键靶点的对比结果如表3所示｡
加权前与加权后的对比结果显示,20个关键靶点中有8个为加权前后所共有的,分别是:TP53､MAPK1､MAPK3､AKT1､NFKB1､RELA､ESR1､CASP3｡
TP53是人体中重要的抑癌基因,TP53基因的突变与肝癌的发生､发展密切相关｡马洪斌等选择原发性肝癌组织和癌旁组织各112例份,检测p53蛋白表达,结果表明原发性肝癌组织p53蛋白相对表达量均明显高于癌旁组织(P<0.05),其表达变化与肿瘤进展和患者预后不良有关｡
MAPK信号通路几乎存在于所有真核细胞中,其主要功能为将胞外信号经Ras､Raf､MEK及MAPK特异性磷酸化传递到胞内,并参与细胞增殖､分化和迁移｡MAPK信号通路在50%~100%的肝癌中异常活化,并与肝癌的发生､侵袭､转移和肿瘤血管形成等过程密切相关｡冯子强等研究表明,人参中的人参皂苷Rh2可通过激活MAPK通路来抑制肝癌HepG2细胞的迁移｡MAPK1是MAPK家族中的一员,MAPK1调控异常与肿瘤发生发展密切相关｡李晓楠等研究发现,黄芩中的汉黄芩素可以直接抑制肝癌细胞SMMC-7721生长,减少肝癌细胞的迁移率,减缓肝癌细胞生长融合时间｡张锐等研究表明,在体内,20(S)-原人参二醇可抑制肝癌SMMC-7721细胞裸鼠异种移植瘤的生长;在体外,20(S)-原人参二醇对肝癌细胞的增殖具有明显的抑制及诱导其凋亡的作用,且呈时间和剂量依赖性｡
PI3K-Akt信号传导途径可被多种类型的细胞刺激或毒性刺激所激活,并调节转录､翻译､增殖､生长和存活等基本细胞功能｡该途径一旦激活,Akt可重新定位到细胞质､细胞核或细胞内的其它部位,磷酸化大量的底物蛋白,进而调节细胞的功能,异常活化的Akt会导致肿瘤发生｡孙佳等研究表明,槲皮素能诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡,其机制可能是下调PI3K-Akt通路,增强凋亡因子与降低抗凋亡蛋白的活性,促进肝癌细胞的凋亡｡Zhu等研究表明,山柰酚可通过下调miR-21和灭活PI3K-Akt信号通路来抑制HepG2肝癌细胞的增殖､迁移和侵袭｡MAPK信号通路与PI3K-Akt信号通路部分如图6所示｡
加权前与加权后的结果对比显示,GAPDH､HRAS､EGFR､TNF､MYC､BRCA1､STAT3､JUN､PTGS2､F2､MAPK8､DRD2为加权后特有的关键靶点｡
JUN(c-Jun)蛋白是AP-1复合物中的转录因子,目前已证实c-Jun蛋白高表达与多种恶性肿瘤的发生和预后密切相关｡杨跃武等研究表明,c-Jun蛋白可能在肝癌的发生､发展中起重要作用,并影响肝癌患者的术后生存｡
PTGS2即为环氧合酶COX2的别称,是前列腺素合成的主要限速酶,受到炎症､肿瘤等外界刺激时发生高表达｡已有研究表明在未受乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染的肝癌患者中,初次治疗后,服用COX2抑制剂美洛昔康可能会抑制肝癌的复发｡
结合文献可以看出,加权前后所共有的8个关键靶点中有3个靶点(TP53､AKT1､MAPK1)已有文献证实｡加权后,TP53排名由加权前的第6位上升到第2位,AKT1由加权前的第7位上升到第4位,MAPK1排名略有下降,由加权前的第2位下降到第5位｡加权后所特有的12个关键靶点中,2个靶点(JUN､PTGS2)已有文献证实其在肝癌的发生､发展中的重要作用｡可以看出,加权网络分析后,已有文献证实的关键靶点排名总体上升,个数增加｡可见加权网络对于关键靶点的筛选具有实际意义。
通过建立小柴胡汤活性成分-靶点-通路网络并进行网络拓扑分析发现,小柴胡汤中的黄连碱､黄芩素､胡萝卜甙等活性成分Pi值较高,在网络中属于重要活性成分｡小柴胡汤中的黄连碱作用于FGFR1(RTK家族,图6中①)､KDR(RTK家族,图6中①)､Raf1(Raf家族,图6中②)､MAP2K1(MEK家族,图6中③)､MAPK1(ERK家族,图6中④)､Akt1(Akt家族,图6中⑤),推测黄连碱可能通过抑制上述靶点活性起到抗肝癌作用;小柴胡汤中的黄芩素作用于FGFR1､MAPK1､Akt1等靶点,推测黄芩素可能通过作用于上述靶点达到抗肝癌效果;胡萝卜苷作用于MAPK1等靶点,推测其可能通过抑制MAPK1､Akt1活性从而诱导肝癌细胞凋亡｡
综上所述,本研究通过TCMSP､PubChem､STRING､GEO等数据库和TCMKD1.0､Cytoscape3.7.1等软件分析预测了小柴胡汤抗肝癌的靶点和通路,并通过构建加权网络更加精确地揭示其抗肝癌的作用机制｡研究结果与现有抗肝癌靶蛋白的药理作用研究一致｡小柴胡汤通过调控20多个重要靶点,整体协同发挥抑制肿瘤生长､促使肿瘤细胞凋亡的作用,充分体现了中药多成分-多靶点-多通路协同作用的特点,为进一步深入研究小柴胡汤抗肝癌的作用机制提供了参考｡
版权声明：本文来源于《中国药物化学杂志》2020, 30 (11)。中药大品种联盟（BBTCML）编校发布。编辑：远志。转载请标注作者及出处。本公众号文章、图片、视频版权归原作者所有，仅供学习参考，如有侵犯版权请联系中药大品种联盟秘书处，我们将及时回复。
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