小柴胡汤治疗早期新型冠状病毒肺炎（COVID-19）邪热郁肺、枢机不利证功效网络分析与机制预测

摘要：目的研究小柴胡汤在治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）邪热郁肺、枢机不利证过程中的功效作用网络及潜在机制，分析方剂中抗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的活性成分。方法首先查阅文献分析COVID-19邪热郁肺、枢机不利证与小柴胡汤适应证的方证对应关系，继而运用网络药理学技术Cytoscape 3.6.0等软件分别构建小柴胡汤中药方剂-活性成分-关键靶点功效作用网络，并确认方中抗SARS-CoV-2活性成分，在多方面分析小柴胡汤治疗早期COVID-19邪热郁肺、枢机不利证的功效作用及机制。结果已有文献报道中药潜在抗SARS-CoV-2活性成分48个；共分析出小柴胡汤中治疗肺炎、调节免疫的活性成分140个，其中黄芩素、芒柄花素、槲皮素等12个成分具有潜在抗SARS-CoV-2活性。小柴胡汤中活性成分通过IL-6、NOS2、ESR1等95个关键靶点进行肺炎治疗和免疫调节，涉及TNF信号通路、IL-17信号通路、甲型流感等多条通路。基因共表达和蛋白-蛋白互相作用（PPI）分析发现，血管紧张素转化酶II（ACE2）仅与上述靶点中NOS2具有共表达，并且在PPI互作网络中也仅与5个靶点有相互作用关系，推测ACE2靶点仅在SARS-CoV-2入侵人体的时候起到重要作用，而在病毒感染后的肺炎治疗中作用甚微。结论小柴胡汤中活性成分在抑制SARS-CoV-2活性、阻断SARS-CoV-2入侵途径、抑制炎症风暴、调节机体免疫等多方面发挥治疗COVID-19的作用；值得注意的是针对ACE2靶点设计药物可阻断病毒入侵，但对肺泡内炎症等病变疗效可能不佳，所以，这也为小柴胡汤对早期COVID-19治疗提供了多靶点、多向性空间。另外，小柴胡汤用于治疗早期COVID-19时尤应注意精准辨证用药，一是避免产生不良反应，二是避免加重COVID-19病情出现细胞因子损伤。

新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是人体感染新型冠状病毒（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）而引起的一种急性呼吸道传染病，以发热、干咳、乏力为主要表现，少数患者有鼻塞、咽痛、腹泻等症状[1]。国家卫生健康委员会、中医药管理局及各地主管部门迅速对疫情做出应对，积极出台诊疗以及预防方案[2-3]，随着对COVID-19的深入认识和临床经验的积累，中医在这场抗疫大战中逐渐从参与者变成主力军[4]，其中小柴胡汤被多地、多部门联袂推荐使用，而最近被推荐的清肺排毒汤也是由小柴胡汤与麻杏石甘汤、射干麻黄汤、五苓散合方而成，可见仲景古方正在治疗新病中发挥重要作用。

目前，运用分子对接技术，肖小河课题组[5]基于临床经验筛选发现了46个能作用于SARS-CoV-2S-蛋白与人体血管紧张素转化酶II（ACE2）结合区域且具有较低结合能的中药活性成分，Zhang等[6]在评估了潜在活性成分ADME后筛选出了13个与SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶（PLpro）、3C样蛋白酶（3CLpro）和棘突糖蛋白（Spike）具有较低结合能的活性成分，李婧等[7]、宗阳等[8]基于文献挖掘筛选出了44个与SARS-CoV-2的3CLpro蛋白具有较低结合能的活性成分。小柴胡汤中柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、甘草药味已经包含在上述筛选中，本研究基于现有资料，对小柴胡汤与COVID-19出现的证候表征进行方证对应关系分析，运用网络药理学技术研究小柴胡汤中抗SARS-CoV-2的活性成分，分析方剂在治疗COVID-19过程中的功效作用及机制，并对潜在的肝毒性进行探讨，为小柴胡汤临床安全应用提供数据支持。

1方法

1.1方证关系分析

查阅文献以及临床报道，总结小柴胡汤主要的临床应用和药理学研究，并且针对COVID-19出现的证候表征与小柴胡汤适应证进行方证关系分析，为后续功效分析奠定基础。

1.2活性成分搜集

检索PubMed、中国知网等数据库，下载与抗SARS-CoV-2中药活性成分筛选相关的文献，并将文献分析的药效成分进行整理。借助TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、TCMID数据库[12]（http://www.megabionet.org/tcmid/）以小柴胡汤方中药味柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣为关键词检索收集其化学成分，并且以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选。

1.3潜在靶点预测

将1.2项收集到的小柴胡汤中活性成分输入TCMSP数据库获得化合物的预测蛋白靶点，并运用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将所有靶点名称校正为官方名称（official gene symbol）。在PubMed数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）、CTD数据库（http://ctdbase.org/）和OMIM数据库（http://omim.org/）分别以pneumoniaregulates immune为关键词获取肺炎、免疫调节相关潜在靶点，合并3个数据库信息并保留唯一值。

1.4作用网络构建与分析

首先将收集到的肺炎、免疫调节相关潜在靶点分别输入STRING（https://string-db.org/）网站获得蛋白-蛋白互作（PPI）网络；运用Cytoscape 3.6.0软件构建小柴胡汤-化学成分-作用靶点关系网络。然后运用Cytoscape软件中Merge功能分别将小柴胡汤-化学成分-作用靶点关系网络与肺炎、免疫调节潜在靶点PPI互作网络做交集处理，并且根据靶点度（degree）值的2倍中位数为条件进行关键作用网络的筛选，获得小柴胡汤-化学成分-肺炎关系网络、小柴胡汤-化学成分-免疫调节关系网络[9]。最后运用Cytoscape 3.6.0软件中NetworkAnalyzer功能进一步对上述关系网络进行分析，将方中成分、作用靶点以度值进行排序作图，分析方剂在治疗COVID-19过程中的作用；明确方中抗SARS-CoV-2的活性成分，并抽提出抗病毒成分作用网络进行分析。

1.5关键靶点分析

运用STRING（https://string-db.org/）、Cytoscape 3.6.0软件中ClueGO插件将1.4项分析得到的关键基因进行基因共表达分析、通路富集分析。

2结果

2.1方证关系分析

小柴胡汤为张仲景所创，由柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、甘草、大枣7味中药组成，是和解少阳的经典名方，临床上常被用来治疗肺系统、免疫系统等疾病[10-11]。COVID-19是SARS-CoV-2通过结合人体ACE2受体而引起的一种急性呼吸道传染病，主要临床表现为发热、干咳、乏力，中医认为其属于瘟疫范畴，基本病机特点为湿、毒、瘀、闭，病位在肺、大肠、脾、胃，从少阳半表半里，到胃和大肠阳明经均遭波及[12]。

COVID-19为湿毒所致，极易阻滞气机，致使肺气郁闭，出现胸闷喘促，气机不利，肺失宣肃，气机郁闭等证状，发病早期以邪热郁肺、枢机不利，邪热壅肺、肺失宣降两大证型为主[13]。因此，及时化湿理气，调畅气机，防止湿邪闭阻气机形成疫毒闭肺，在疫情的防治中极为关键。针对邪热郁肺、枢机不利型的COVID-19，小柴胡汤中君药柴胡透散湿热、调畅气机，黄芩清热燥湿，人参、半夏扶正益气，生姜、大枣护脾和胃，甘草生用既能清热解毒，又可调和诸药，诸药合用，共奏祛湿防疫之功。

据统计，COVID-19患者最常见的症状是发热（87.9%）和咳嗽（67.7%），腹泻（3.7%）和呕吐（5.0%）较为少见，部分患者发热往往呈现持续反复波动的特点；《伤寒论》原文中记载往来寒热，胸胁苦满，默默不欲饮食，心烦喜呕，或胸中烦而不呕，或渴，或腹中痛，或胁下痞硬，或心下悸、小便不利，或不渴、身有微热，或咳者，小柴胡汤主之，患者出现的往来寒热以及胸闷、咳嗽、食欲不振、情绪低落等症状均符合小柴胡汤适应证[14]。

2.2活性成分确定

中药抗SARS-CoV-2活性成分共收集到48个。肖小河课题组[5]在桑叶、甘草、金银花等40味中药405种候选成分中筛选出了抗病毒活性成分46个；Zhang等[6]筛选了125种潜在抗病毒中草药，筛选出了抗病毒活性成分13个，并分析了这些成分主要来自连翘、甘草、柴胡等26味中药；李婧等[7]在板蓝根、金银花、黄芩等11味中药469个候选成分中筛选出了抗病毒活性成分41个；宗阳等[8]在达原饮中筛选出了抗病毒活性成分5个；具体活性成分及与蛋白结合自由能，见表1。小柴胡汤中活性成分共收集到188个，其中10个成分在多味药材中均含有，方中各味中药活性成分数量，见表2。

通过Venn图（图1）可以看到，小柴胡汤中共有黄芩素（baicalein）、芒柄花素（formononetin）、槲皮素（quercetin）等12个成分具有直接抗SARS-CoV-2活性。另外柴胡皂苷a（saikosaponina）、柴胡皂苷b2（saikosaponin b2）、柴胡皂苷d（saikosaponin d）、甘草酸（glycyrrhizicacid）OB值或DL值低于筛选条件，鉴于这些成分具有潜在抗SARS-CoV-2活性，且以往报道具有抗病毒作用[15-18]，所以也纳入了此次研究。

2.3潜在靶点预测

在TCMSP数据库、TCMID共得到小柴胡汤成分作用靶点411个，方中各味中药活性成分作用的靶标数量，见表2。

通过PubMed数据库、CTD数据库和DrugBank数据库共获得肺炎潜在靶点242个，调节免疫潜在靶点1 292个。

2.4作用网络构建与分析

通过Cytoscape 3.6.0软件构建了小柴胡汤治疗肺炎、调节免疫的作用网络，网络中节点的大小与度值呈正比关系，节点的度值越大，说明这个节点在网络中的作用越大。

2.4.1治疗肺炎网络小柴胡汤中槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、汉黄芩素（wogonin）、异鼠李素（isorhamnetin）、甘草酸（glycyrrhizic acid）、芒柄花素（formononetin）、人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）、β-胡萝卜素（beta-carotene）等111个活性成分作用于NOS2、IL6、TNF、STAT3、VEGFA、CXCL8、NOS3、MMP9、CCL2、ALB等55个靶点发挥治疗肺炎的作用；其中槲皮素来自柴胡、大枣、甘草，山柰酚来自柴胡、人参、甘草，黄芩素来自黄芩，3种活性成分分别调控33、11、5个靶点，见图2。

药理实验表明槲皮素、黄芩苷均可降低流感病毒感染小鼠死亡率和肺指数，同时可抑制病毒的复制，减轻肺部的炎症，保护流感病毒感染的小鼠肺部功能[19-20]。目前白细胞介素6（IL-6）和C反应蛋白（CRP）已被用作肺炎患者的预后生物标志物，其表达水平越低代表患者预后越好[21-22]。另有实验表明VEGF-A水平升高可能与肺部炎症消退有关[23]。基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)在社区获得性肺炎患者血清中的水平显著增加，在治疗后与健康者无差异，可作为诊断的一种血清标志物[24]。

2.4.2调节免疫网络小柴胡汤中槲皮素（quercetin）、汉黄芩素（wogonin）、山柰酚（kaempferol）、β-胡萝卜素（beta-carotene）、柚皮素（naringenin）、异鼠李素（isorhamnetin）、芒柄花素（formononetin）、甘草查耳酮a（licochalcone a）、6-姜酚（6-gingerol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等134个成分通过ESR1、PPARG、MAPK14、GSK3B、STAT3、JUN、AKT1、VEGFA、CASP3等73个靶点调节人体免疫功能；槲皮素作用靶点51个，为方中最多，汉黄芩素17个次之，随后为山柰酚16个，见图3。

实验研究表明槲皮素可以显著增强环磷酰胺造成的免疫低下小鼠的免疫功能[25]，汉黄芩素可通过增加免疫细胞的浸润、调节免疫细胞的表型、以及促进相关细胞因子的分泌来增强免疫功能[26]。p38（MAPK14）信号通路在先天性和适应性免疫反应中的作用已被证实，特别是在树突状细胞（DC）产生炎性细胞因子方面[27-28]。巨噬细胞被激活，引发先天免疫反应，Akt途径会收敛炎症和代谢信号，从而调节巨噬细胞反应，从而调节其激活表型[29]。FOXO通过负调节基质细胞中免疫抑制蛋白和血管内皮生长因子（VEGF）的表达来促进抗肿瘤活性，这可以在细胞微环境中形成免疫耐受状态[30]。

2.4.3抗SARS-CoV-2活性成分网络在小柴胡汤治疗肺炎和调节免疫网络中，将具有抗SARS-CoV-2的活性成分相关的作用网络抽提出来进行进一步分析。在治疗肺炎网络中有来自6味中药的10个活性成分与44个靶点相互作用，见图4；在调节免疫网络中有来自6味中药的12个活性成分与63个靶点相互作用，见图5。目前通过对已有报道的抗病毒活性成分筛选小柴胡汤药效成分，可看到小柴胡汤7味中药中，除生姜外都具有抗SARS-CoV-2的活性成分，君药柴胡和佐使药甘草都含有5个，其次为黄芩和大枣各含有3个，这表明小柴胡汤具有极大的抗SARS-CoV-2潜力。

抽提出来的治疗肺炎网络活性成分由原来的111个减少到10个，免疫调节网络则由134个减少到12个，2个网络在活性成分的数量上均减少了90%左右，但可以看到，网络中作用靶点并没有减少太多，这进一步说明了小柴胡汤中的这12个成分不仅具有抗SARS-CoV-2的活性，而且在治疗肺炎和调节人体免疫方面同样具有良好的作用，佐证了小柴胡汤被推荐为此次COVID-19的预防治疗处方的正确性。

2.4.3抗SARS-CoV-2活性成分网络在小柴胡汤治疗肺炎和调节免疫网络中，将具有抗SARS-CoV-2的活性成分相关的作用网络抽提出来进行进一步分析。在治疗肺炎网络中有来自6味中药的10个活性成分与44个靶点相互作用，见图4；在调节免疫网络中有来自6味中药的12个活性成分与63个靶点相互作用，见图5。目前通过对已有报道的抗病毒活性成分筛选小柴胡汤药效成分，可看到小柴胡汤7味中药中，除生姜外都具有抗SARS-CoV-2的活性成分，君药柴胡和佐使药甘草都含有5个，其次为黄芩和大枣各含有3个，这表明小柴胡汤具有极大的抗SARS-CoV-2潜力。

抽提出来的治疗肺炎网络活性成分由原来的111个减少到10个，免疫调节网络则由134个减少到12个，2个网络在活性成分的数量上均减少了90%左右，但可以看到，网络中作用靶点并没有减少太多，这进一步说明了小柴胡汤中的这12个成分不仅具有抗SARS-CoV-2的活性，而且在治疗肺炎和调节人体免疫方面同样具有良好的作用，佐证了小柴胡汤被推荐为此次COVID-19的预防治疗处方的正确性。

2.5关键靶标分析

由于STRING软件的限制，将小柴胡汤治疗肺炎和调节免疫各自度值排名前20位的基因与ACE2进行基因共表达分析。结果显示，ACE2仅与NOS2具有共表达，并且在PPI互作网络中也仅与MAPK3、IL-6、NOS3等5个靶点有相互作用关系，见图6。ACE2作为SARS-CoV-2的重要受体[31]，在病毒入侵人体的过程中起到重要作用，但其在病毒感染后的肺炎治疗中可能作用甚微。

通路富集分析显示小柴胡汤在治疗COVID-19过程中主要涉及TNF信号通路（TNFsignaling pathway）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、癌症通路（pathways in cancer）、甲型流感（Influenza A）、卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’ssarcoma-associated herpesvirus infection）等多条信号通路，见图7。

COVID-19患者出现多脏器损伤，其可能的机制是SARS-CoV-2结合ACE2，使人体细胞中ACE2与CAE表达失衡，Ang-(1-7)水平下降，而Ang II表达升高，进而引发炎症瀑布反应，造成肺炎、心力衰竭等多脏器损伤[32]。而调节NF-κB/MAPK信号通路，可以减轻肺组织的炎症[33-34]。王婷婷等[35]

实验发现槲皮素抑制金黄色葡萄球菌肺炎小鼠炎症反应可能与其抑制IKK/NF-κB/IκB炎症信号通路有关。汉黄芩素则通过抑制TLR7介导的MyD88依赖性信号通路，抑制了NF-κB p65的核转位及表达，从而减轻病毒感染后的炎症反应[36]。

3讨论

小柴胡汤出自《伤寒论》，由柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、甘草、大枣7味中药组成，为和解少阳的经典名方，具有和解表里的功效。COVID-19是SARS-CoV-2通过结合人体ACE2[37]、TMPRSS2、AAK1[38]等蛋白而引起的一种急性呼吸道传染病。目前认为，重症肺炎的产生并非是病毒本身，而是由于病毒诱发了机体产生失调的、过度的免疫应答，从而引起患者体内炎症因子过度表达而出现细胞因子风暴，这是造成肺炎及急性肺损伤的一个重要的原因；抑制体内TNF-α表达，促进抗炎因子IL-10分泌，进而减轻过度免疫激化导致的肺部组织损伤，并可以部分降低病死率[39-40]。现代药理学研究表明小柴胡汤对免疫系统具有良好的调节作用，能够调节淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞以及相关免疫因子[41]。

以中医理论为指导，基于网络药理学对小柴胡汤治疗COVID-19进行了深入分析，结果发现小柴胡汤中有12种抗SARS-CoV-2的活性成分，其中黄芩素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、芒柄花黄素通过结合人体ACE2受体阻断病毒的入侵，柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷d、甘草酸、β-胡萝卜素、黄连碱通过结合病毒3CLPro蛋白抑制病毒的复制，马兜铃酰胺通过结合病毒PLpro蛋白抑制病毒的复制，而槲皮素、山柰酚对这3个蛋白都有结合能力，这表明了小柴胡汤具有抗SARS-CoV-2的作用。网络分析发现，在病毒感染后的肺炎治疗中，小柴胡汤中111个活性成分作用于NOS2、IL6、TNF等55个靶点直接发挥治疗肺炎的作用，134个成分通过ESR1、PPARG、MAPK14等73个靶点调节人体免疫功能以扶正祛邪。进一步分析了方中12个抗SARS-CoV-2活性成分在治疗肺炎和调节免疫的能力，发现这12个活性成分几乎可以调控肺炎网络和免疫网络中的所有靶点。这说明了小柴胡汤在治疗COVID-19具有巨大的潜力。基因共表达和PPI互相作用分析结果表明，ACE2与COVID-19治疗相关的靶点关系并不密切，所以推测ACE2受体仅在病毒入侵人体的过程中起到重要作用，而在病毒感染后的肺炎治疗中可能作用甚微，所以针对ACE2靶点设计药物可阻断病毒入侵，但对肺泡内炎症等病变可能疗效不佳，提示临床应坚持中西医并重，多方面联合治疗。

李晓骄阳等[42]分析了目前临床用于治疗COVID-19常用药物的肝损伤作用情况，包括洛匹那韦/利托那韦、α-干扰素、利巴韦林等化学药和柴胡、半夏、附子等中药都能造成一定程度的肝损伤，警示在COVID-19的治疗过程中注重合理用药，最大程度地减少肝损伤的发生。刘静等[43]运用网络药理学方法整体分析了小柴胡汤导致肝损伤的机制，与Ras/Raf/MEK/ERK等信号传导途径密切相关。另外值得注意的是在日本小柴胡事件中，由于不辨证候、长期大剂量的服用小柴胡颗粒而导致了间质性肺炎的发生[44]，而此次小柴胡汤被用于治疗COVID-19应当注意辨证论治、合理应用，一是避免产生不良反应，二是避免加重病情出现细胞因子损伤。

本研究运用网络药理学方法对小柴胡汤治疗COVID-19进行了分析，预测的活性成分以及作用靶点仍需进一步体内外实验验证。另外药材炮制导致的成分变化、体内代谢导致的成分转化以及成分的量效关系等问题是网络药理学现在的短板和亟待发展的地方，例如药材不同炮制品的成分应当加以区分，并且这也是相对容易实现的，各大数据库应当积极改进。

参考文献（略）

来  源：孙凯滨,张新雨,刘静,孙蓉.小柴胡汤治疗早期新型冠状病毒肺炎(COVID-19)邪热郁肺、枢机不利证功效网络分析与机制预测[J/OL].中草药，[2020-03-14]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20200312.1550.002.html.