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小柴胡汤对非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的保护作用研究

admin1天前皮肤科1

摘要：目的通过构建蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）模型，研究小柴胡汤对NASH模型小鼠的保护作用。方法选择C57BL/6小鼠为研究对象，将其随机分为对照组、模型组、小柴胡汤（高、中、低剂量）组、易善复组和强肝胶囊组。通过饲喂MCD饲料建立NASH模型，造模同时按分组给予不同药物进行干预；实验过程中记录小鼠体质量、日摄食量、日饮水量变化，实验结束对肝组织进行HE染色观察病理变化，检测血清生化指标丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平变化，检测肝组织中TC、TG的水平变化，利用qRT-PCR技术检测肝组织脂肪酸合成酶（FAS）和固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）的表达水平。结果小鼠体质量、日摄食量、日饮水量及肝脏系数等数据显示MCD饮食诱导的模型组小鼠会出现体质量降低、摄入量减少及肝脏湿质量下降的特点，而小柴胡汤给药组小鼠体质量、摄入量及肝脏系数较模型组小鼠显著升高；HE染色结果显示小柴胡汤可明显减轻肝组织脂肪变性和炎症程度，改善肝细胞的形态和结构；生化指标检测结果显示小柴胡汤能显著降低NASH模型小鼠血清及肝组织TG、TC水平，升高血清中HDL-C水平，降低血清中AST、ALT、IL-6、TNF-α水平；qRT-PCR结果显示模型组小鼠肝组织FAS和SREBP-1c的基因表达水平明显升高，小柴胡汤可显著降低FAS和SREBP-1c的基因表达水平。结论小柴胡汤对MCD饮食诱导的NASH模型小鼠有明显保护作用，其机制可能通过调控抑制脂肪酸合成基因（FAS、SREBP-1c）的表达，减少脂肪堆积，实现调脂作用，并通过抑制炎症因子的表达改善肝组织的损伤。

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）又称代谢性脂肪性肝炎，是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进一步进展，以脂肪变性、肝细胞气球样化和小叶炎症为特征[1-2]。普通成人NASH患病率为3%～6%，并已成为肝硬化、肝细胞癌和肝移植愈来愈重要的危险因素，目前NASH全球患病率逐年增加，已成为严重的全球性公共健康问题[3]。传统医学并无NASH的病名，根据其临床表现，将其归于胁痛痞满肝胀肝痞肝癖肝着积聚痰证痰浊湿阻瘀证肥气积证等范畴[4-5]，多因饮食不节、劳逸失度、情志失调、久病体虚、禀赋不足伤及肝、脾、肾等脏腑；以肝体用失调、脾肾亏虚为主要特点，痰、湿、浊、瘀、热为主要病理因素；中医治疗多以疏肝解郁、祛湿化痰、活血化瘀为主，根据病情佐以清热、解毒、养肝、利胆、化积等方法。

小柴胡汤出自张仲景《伤寒杂病论》少阳病篇第96条，为少阳枢机之剂，和解表里总方，由柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣7味药组成，具有和解少阳之功，主治伤寒少阳证，症见寒热往来、胸胁苦满、默默不欲饮食、心烦喜呕、口苦、咽干、目眩、舌苔薄白、脉弦者[6]。现代临床可用于NAFLD及病毒性肝炎、酒精性肝炎等的治疗[7-11]，实验研究证明小柴胡汤具有解热、抗菌、抗炎、抗病毒、保肝、调节脂质代谢、抗氧化及免疫调节等药理作用[12-15]。小柴胡汤可疏解气郁、调达枢机，方中柴胡、黄芩疏利肝胆、清热燥湿；半夏、生姜化痰降浊、和胃止呕；人参、大枣、甘草健脾和中、益气生津，以达疏肝利胆、清解湿热的功效恢复肝脏生理功能。因此，本实验观察小柴胡汤对蛋氨酸-胆碱缺乏（methionine-choline-deficient，MCD）饮食诱导的NASH模型小鼠的药效作用及其机制，为其临床应用提供依据。

1材料

1.1动物

SPF级的C57BL/6雄性小鼠共70只，6～7周龄，体质量18～22 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号［SCXK（京）2016-0006］，饲养条件：室温20～25℃，通风性良好。实验动物福利伦理批准号［KYLL-2018（KJ）A-0089］，所有动物实验流程均严格遵循中国实验动物管理协会的伦理准则给予人道主义关怀。

1.2药品

小柴胡汤中柴胡、黄芩、人参、甘草、半夏、生姜、大枣购自山东百味堂中药饮片有限公司，由山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定，分别为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根、黄芩属植物黄芩ScutellariabaicalensisCeorgi的干燥根、五加科人参属植物人参Panax ginsengC. A. Mey.的根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎、天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的块茎、姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎、鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实，按《中国药典》2015年版柴胡、黄芩、人参、甘草、半夏、生姜、大枣项下检查，符合各项规定。多烯磷脂酰胆碱胶囊（易善复），赛诺菲（北京）制药有限公司生产，批号5JD189；强肝胶囊，石家庄东方药业有限公司生产，批号20190515。

1.3试剂

MCD和蛋氨酸-胆碱充足饲料（methionine- choline-sufficient，MCS）购自南通特洛菲饲料科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒购买于南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫试剂盒和白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫试剂盒购于上海易利生物科技有限公司；脂肪酸合成酶（FAS）和固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；HiScript Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）和AceQqPCR SYBR Green Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.4仪器

TDZ5-WS型台式低速离心机，湘仪（湖南）离心机仪器有限公司；MultiskanGo-1510全波长酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；可调式移液器，上海赛默飞世尔仪器有限公司；PCR扩增仪、实时定量PCR仪，德国艾本德股份公司。

2方法

2.1小柴胡汤煎剂的制备

按照《伤寒论》原方比例：柴胡半斤（24 g）、黄芩三两（9 g）、人参三两（9 g）、甘草三两（9 g）、半夏半升（9 g）、生姜三两（9 g）、大枣四枚，称取小柴胡汤各药味，加入10倍量水，加热回流提取2次，每次提取时间为1.5 h，合并滤液，浓缩药液至所需浓度。

2.2分组、造模及给药

将70只SPF级的C57BL/6雄性小鼠分为对照组，模型组，小柴胡汤高、中、低剂量（其剂量设置参考高等医药院校教材《方剂学》以及《伤寒论》中小柴胡汤药味用量，即70 kg成人日服用量为78 g，按小鼠与人体表面积比值进行计算：小鼠ig给药小柴胡汤高、中、低剂量分别为40.56、20.28、10.14 g/kg，分别相当于人日用量的4、2、1倍）组，易善复（多烯磷脂酰胆碱胶囊，其成人日用量最高为1.37 g，按小鼠与人体表面积比值折算，小鼠ig给药剂量为0.18 g/kg）组，强肝胶囊（其成人日用量最高为4 g，按小鼠与人体表面积比值计算，小鼠ig给药剂量为0.52 g/kg）组；每组10只。对照组小鼠予以MCS饲料，模型组及各给药组小鼠均将MCS和MCD饲料按一定比例适应性喂养1周后，给以完全MCD饲料，持续4周，制备NASH模型。自造模同时，各给药组按给药剂量ig给药，给药体积10 mL/kg，对照组和模型组小鼠均ig等体积蒸馏水。

2.3指标检测

2.3.1摄食量、饮水量及体质量测定每4天对各组小鼠摄入量及体质量进行测定并记录，计算小鼠体质量自身变化率及日摄食量、日饮水量的变化。

2.3.2血清及肝生化指标测定给药干预4周后，小鼠提前12 h禁食，麻醉动物，摘除眼球采血于1.5 mL EP管中，静置2 h，在4℃预冷的离心机3 500 r/min离心10 min后，吸取上清液，测定血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C、IL-6和TNF-α的浓度。制备肝组织匀浆，检测肝组织TC、TG的浓度。取肝称质量并计算肝脏系数，取各组小鼠相同部位的部分肝大叶于1.5 mL EP管中−80℃冻存，用于后续实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验。

2.3.3肝组织病理检查将每只小鼠相同部位肝组织置于4%多聚甲醛中固定，后续脱水、包埋和切片，进行HE染色，观察肝脏病理变化，对NAFLD活动度积分进行统计学评价[16]。

2.3.4qRT-PCR检测相关基因取各组小鼠冻存的部分肝组织，按照说明书提取总RNA，并逆转录合成cDNA。对FAS、SREBP-1c采用实时荧光定量PCR仪进行相对定量分析，目标基因的相对定量用2−ΔΔCt公式计算，实验所需各引物序列见表1。

2.4统计学分析

应用GraphPad Prism7统计软件进行统计学分析，结果用表示，组间进行单因素方差分析。

3结果

3.1小柴胡汤对NASH模型小鼠体质量、日摄食量、日饮水量和肝脏系数的影响

实验期间，小鼠的体质量变化及自身变化率结果见图1-A，对照组小鼠体质量增长稳定，模型组小鼠体质量出现明显下降；与模型组相比，小柴胡汤高剂量组及易善复组、强肝胶囊组给药12 d后，小鼠体质量出现增长情况，小柴胡汤中剂量组小鼠体质量稳定，小柴胡汤低剂量组小鼠体质量降低。

各组小鼠的日摄食量、日饮水量结果见图1-B，对照组小鼠进食正常，与对照组比较，MCD饲料喂养后，模型组和各给药组小鼠摄入量显著降低，自给药12 d后，各给药组小鼠摄入量稳定但均低于对照组。

实验结束，小鼠的肝脏湿质量及肝脏系数结果见图1-C，对照组小鼠肝湿质量和肝脏系数分别为（1.06±0.09）g、（4.40±0.36）%，模型组小鼠肝湿质量和肝脏系数分别为（0.93±0.08）g、（5.20±0.48）%。与模型组相比，各给药组小鼠肝脏系数显著降低（P＜0.05），以上数据说明MCD饮食诱导的小鼠模型会出现体质量降低、摄入量减少及肝脏湿质量下降的特点，小柴胡汤可显著改变NASH模型小鼠体质量、摄入量及肝脏系数。

3.2小柴胡汤对NASH模型小鼠肝组织病理变化的影响

MCD饮食由于缺乏蛋氨酸在体内无法合成低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），三酰甘油转移受阻而导致小鼠脂肪变性，因此，NASH小鼠模型出现明显的脂肪堆积和变性等病理特点[17]。HE染色结果显示，对照组小鼠的肝细胞结构完整，以中央静脉为中心有序排列，无明显脂滴；模型组小鼠肝细胞基本结构被破坏，脂质堆积面积增多，脂滴变大，出现严重的脂肪变性，胞质挤满空泡，以浸润为主的坏死性炎症，胞核呈现固缩，聚集的状态。与模型组相比，小柴胡汤中、高剂量组及易善复组、强肝胶囊组在肝细胞的形态和结构上都有明显改善，脂肪变性的空泡和炎症均可见明显减少，细胞呈现有序排列状态，且有明显剂量相关性，见图2，小柴胡汤对NASH模型小鼠肝组织病理评分的影响结果见表2。

3.3小柴胡汤对NASH模型小鼠血清中TC、TG、HDL-C水平的影响

与对照组相比，模型组小鼠血清中TC、TG水平均极显著升高（P＜0.01），HDL-C水平极显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，小柴胡汤高剂量组、易善复组、强肝胶囊组小鼠血清中TC、TG水平极显著降低（P＜0.01），小柴胡汤中剂量组小鼠血清中TC、TG水平显著降低（P＜0.05）；小柴胡汤中、高剂量组及易善复组、强肝胶囊组小鼠血清HDL-C水平极显著升高（P＜0.01），说明小柴胡汤可显著调节NASH小鼠的血脂水平且呈现剂量相关性。结果见图3。

3.4小柴胡汤对NASH模型小鼠肝组织中TC、TG水平的影响

与对照组相比，模型组小鼠肝组织中TC、TG水平均显著升高（P＜0.01），说明MCD饮食诱导的NASH模型小鼠肝脏出现严重脂肪堆积。与模型组相比，小柴胡汤中剂量组、小柴胡汤高剂量组、易善复组、强肝胶囊组小鼠肝组织中TC、TG水平极显著降低（P＜0.01）；说明小柴胡汤可显著降低NASH小鼠的肝脏脂质含量且呈现剂量相关性。结果见图4。

3.5小柴胡汤对NASH模型小鼠血清中ALT、AST水平的影响

ALT和AST的水平为临床常用肝脏功能检测的指标，用于评估肝脏功能或肝损伤，在急性肝炎及慢性肝炎等肝脏疾病，ALT可以评价肝细胞损害程度，反映肝细胞膜通透性的改变[18]，AST则与肝细胞中的线粒体受损相关。如图5所示，与对照组相比，模型组小鼠血清中ALT、AST水平均极显著升高（P＜0.01），说明MCD饮食诱导的NASH模型小鼠出现严重肝脏损伤。与模型组相比，小柴胡汤低剂量组小鼠血清中ALT水平显著降低（P＜0.05）、AST水平极显著降低（P＜0.01）；小柴胡汤高、中剂量组及易善复组、强肝胶囊组小鼠血清中的ALT、AST水平均极显著降低（P＜0.01），说明小柴胡汤可显著改善肝组织损伤。

3.6小柴胡汤对NASH模型小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6水平的影响

MCD饮食由于缺乏蛋氨酸会引起氧化应激而发生肝损伤[19]，而氧化应激的发生会激活炎症反应包括TNF-α等炎症因子的表达[20]。如图6所示，与对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平均极显著升高（P＜0.01），说明MCD饮食诱导的NASH模型小鼠出现严重炎症反应。与模型组相比，小柴胡汤高、中、低剂量组及易善复组、强肝胶囊组小鼠血清中的TNF-α、IL-6水平均极显著降低（P＜0.01），说明小柴胡汤可显著降低炎症因子的释放。

3.7小柴胡汤对NASH模型小鼠肝组织FAS和SREBP-1c表达水平的影响

为了明确小柴胡汤调脂机制，利用qRT-PCR技术对小鼠肝脏中与脂肪代谢有关的关键基因进行分析。如图7所示，与对照组相比，模型组小鼠肝组织FAS和SREBP-1c的mRNA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，小柴胡汤高、中、低剂量组及易善复组、强肝胶囊组小鼠肝组织FAS和SREBP-1c的mRNA水平均显著降低（P＜0.05）；说明小柴胡汤可通过调控FAS和SREBP-1c发挥调脂作用。

4讨论

目前针对NASH不同发病机制的多种新型靶向药物已经相继进入临床试验[21-23]，但受限于潜在不良反应尚未得到一致认可。在整体观念和辨证论治的指导下，中医对NASH认识的逐渐清晰，治疗原则也逐渐呈现多样化。小柴胡汤可针对NASH痰、湿、气滞、血瘀、热的病理因素[24]，诸药合用发挥化痰浊、畅三焦、行气机、解郁结、和枢机之功效。现有研究表明，小柴胡汤在改善肝组织功能、调节脂质代谢上具有明显的疗效和优势[11]。方中所含柴胡皂苷、黄芩苷等主要化学成分可发挥调节脂质代谢、抗氧化、抗凋亡、免疫调节、抗炎等功能保护肝脏组织[25-41]，见图8。

易善复在临床上常与保肝护肝药物联合使用治疗NASH，其主要活性成分为结构和内源性卵磷脂相同的1,2-二亚酰磷脂胆碱（DLPC），实验数据显示易善复可在0.07～0.23 g/kg剂量范围内通过增加肝细胞膜的稳定性维持肝脏等器官及组织的膜功能，通过修复受损肝细胞、加速脂肪分解达到保护肝脏的作用，改善小鼠脂肪肝及肝损伤[42-44]。强肝胶囊有清热利湿、补脾养血、益气解郁的功效，临床多用于慢性肝炎、早期肝硬化病、脂肪肝、中毒性肝炎等的治疗，并具有良好疗效[45-47]；全方16味中药协调配合，在0.15～0.66 g/kg剂量范围内可抑制脂肪肝模型大鼠三酰甘油吸收，增强脂肪分解，改善肝脏微循环的作用，还可通过降低氧化应激、减轻炎症坏死等来恢复肝功能[48-49]。因此，本实验选择易善复和强肝胶囊作为实验阳性药物。

实验结果表明小柴胡汤对MCD饮食诱导的NASH小鼠有明显保护作用。肝脏病理切片及血清生化指标结果表明小柴胡汤能明显改善肝脏脂肪变性和炎症等组织学改变；小柴胡汤可显著降低NASH模型小鼠血清中TG、TC水平，升高HDL-C水平，减少脂肪堆积；降低NASH模型小鼠血清AST、ALT肝损伤标志物的水平；降低血清促炎细胞因子IL-6和TNF-α的释放；证实了小柴胡汤在改善肝组织脂肪变性、抗肝组织炎性反应中的作用。FAS是催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A为脂肪酸的关键限速酶，FAS的表达量增加会导致TG在动物体内的积累[50-51]；SREBP-1c是一个关键的脂肪生成转录因子，通过活化参与脂肪酸和三酰甘油合成的基因来优先调节脂肪生成的过程[52-53]。qRT-PCR结果显示，模型组FAS和SREBP-1c均出现高表达，而小柴胡汤给药组可降低FAS和SREBP-1c的表达水平，说明小柴胡汤可能是通过抑制脂肪合成基因的表达来发挥调脂作用。