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基于肝糖异生的降血糖药物研发进展（独家原创）

admin8小时前皮肤科2

专家介绍

刘浥：1997年本科毕业于复旦大学遗传系；2004年于美国加利福尼亚大学Riverside分校生物医学科学系获得博士学位；2004-2005年在美国加州大学Riverside分校进行博士后研究工作；2005-2009年在美国Salk研究所继续从事博士后研究；2010年1月－2017年8月在中科院营养科学研究所任研究员；2017年9月至今在复旦大学基础医学院任研究员。2010年获得中国科学院百人计划支持。2012年获得国家基金委优秀青年资助。

主要研究方向是运用分子细胞生物学和动物模型探索肥胖相关疾病(特别是2型糖尿病)的病理分子机制。目前的研究集中在转录、转录后以及蛋白质修饰水平上，探寻分子生物钟调控糖脂代谢的机制及其在2型糖尿病发病机制中所扮演的角色。同时基于已发现的分子机制，设计小分子筛选体系，寻找和开发改善糖脂代谢的先导性小分子化合物。

正文

基于肝糖异生的降血糖药物研发进展

陈亚琼1,2，王鹏飞1,2，刘浥3*

（1. 中国科学院上海生命科学研究院营养与代谢重点实验室，上海 200031；2. 中国科学院上海生命科学院健康研究院，上海 200031；3. 复旦大学基础医学院，上海 200031）

[摘要]空腹高血糖既是2 型糖尿病的重要临床诊断指标，也是2 型糖尿病的主要治疗目标之一。肝糖异生亢进是2 型糖尿病患者空腹血糖升高的一个重要病理机制，纠正亢进的肝糖生成有利于控制糖尿病发病进程及并发症。肝糖异生的效率在很大程度上依赖于激素、神经和代谢中间产物对糖异生相关基因的转录调控。因此，开发特异性靶向肝糖异生的抑制剂是降血糖药物研发的一个重要方向。糖异生调节剂包括以下几种类型：受体拮抗剂/激动剂/治疗性抗体、磷酸酶激动剂/抑制剂、转录因子调节剂和糖异生限速酶抑制剂。肝糖异生调节机制研究的进一步深入，将有助于发现更特异的靶点和先导化合物，从而促进新型降血糖药物的开发。

[关键词]肝糖异生；环磷腺苷效应元件结合蛋白；血糖

大规模横断面研究显示以2型糖尿病为特征的代谢综合征的患病率正在逐年上升。国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）发布数据显示：2015年中国已超过印度成为全球第一糖尿病大国，发病率达9.7%，高危人群近1.5亿，因此我国代谢综合征的防控形势严峻。

代谢紊乱是代谢综合征的重要病理机制，而空腹高血糖被广泛认为是代谢紊乱的早期指标。高血糖症是2型糖尿病的重要特点和诊断的主要依据。造成血糖水平持续升高的因素有多种，包括遗传性胰岛素通路缺损、肥胖、运动不足、过量饮食、炎症、高脂肪酸、节律紊乱等。慢性高血糖症进而引起多个组织生理病变：诱发β细胞过度分泌进而衰竭、胰岛α细胞分泌过多胰高血糖素、降低肌细胞吸收血糖的效率、降低脂肪组织对血糖的吸收、诱发外周血管和神经性病变等。由于高血糖症加剧全身胰岛素抵抗反应，增加2型糖尿病并发症的风险，因此控制血糖是2型糖尿病治疗的重要手段之一。

糖异生通过一系列酶促反应利用代谢中间产物（如乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等）重新合成葡萄糖，以维持空腹机体的基础血糖水平。尽管肾脏和小肠也被认为具有糖异生的功能，但在空腹状态下肝脏通过糖异生输出葡萄糖量约占全身血糖供应量的65%因此肝脏对血糖水平的调控（包括吸收血糖、糖原转化和糖异生及输出）具有重要作用。肝糖生成亢进是诱发2型糖尿病人空腹血糖偏高的早期事件；此外，2型糖尿病期间并发的胰高血糖素分泌过多、糖异生底物（血清丙酮酸、丙氨酸）过量及关键限速酶表达过量等现象协同恶化肝糖异生的亢进。因此，肝糖异生亢进是2型糖尿病肝糖输出升高、空腹血糖升高的一个重要病理机制，纠正亢进的肝糖生成有利于控制糖尿病发病进程。

1肝糖异生的分子机制

肝糖异生的效率在很大程度上依赖于激素、交感神经和代谢中间产物对糖异生相关基因的转录调控。胰岛素和其他升糖激素共同调控肝脏的糖异生代谢功能。进食时，血液胰岛素、血糖和脂类水平升高启动脂肪酸、三酰甘油、磷脂以及胆固醇酯在肝脏中的合成，这些脂类或储存于脂滴或细胞膜结构，或以极低密度脂蛋白颗粒分泌到血液。空腹时，血液胰高血糖素水平升高，开启胰高血糖素通路，肝脏首先以糖原裂解和糖异生形式向体液输出葡萄糖；长时间空腹时，肝脏则主要以肝糖异生的形式维持机体的基础血糖水平。目前已知唯一直接抑制肝糖异生的激素为胰岛素，但有多种激素能增强肝糖异生，如最高效的胰高血糖素，肾上腺激素（adrenaline）等，这些激素通过激活各自特异的受体，开启环磷腺苷（cAMP）-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路和（或）Ca流-蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路，快速增强葡萄糖合成，提高机体血糖水平。而糖皮质激素，如皮质醇（cortisol）通过激活糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR），促进激活的GR与靶基因启动子中的糖皮质激素反应元件（glucocorticoidresponseelement，GRE）相结合，在转录水平上直接增强糖异生相关限速酶的转录以升高血糖。

目前对胰高血糖素信号通路研究较为深入。空腹时，胰岛α细胞分泌胰高血糖素，胰高血糖素受体（glucagon receptor，GCGR）被激活，随后活化鸟嘌呤核苷酸结合蛋白激动型α亚基（guanineneucleotidebindingprotein stimulatoryα subunit，Gsα）诱导细胞膜上的腺苷酸环化酶合成cAMP，开启cAMP-PKA信号通路，激活肝细胞中的转录因子——cAMP效应元件（CRE）结合蛋白（cAMP-response elementbindingprotein，CREB），招募相关转录激活因子CBP（CREBbinding protein）和TAF4（TBP associated protein）与转录复合体结合，直接上调肝糖异生途径关键酶如G6Pase和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因的表达；CREB还通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisomeproliferator-activated receptorgamma coactivator 1α，PGC1α）和孤儿核受体NR4A1编码基因的转录，使它们间接而持续地上调其他糖异生必需基因的表达，满足长期空腹时机体对血糖的需求。

长期以来，研究人员认为胰高血糖素的信号转导主要依赖于cAMP-PKA-CREB信号通路，直到10年前发现肝糖异生能够快速、高效启动必须依赖于另一个转录共激活成分：CREB调控的转录共激活因子（CREBregulated transcriptioncoactivators，CRTCs），其具有核质穿梭特点，能够直接与CREB结合并大大增强CREB转录活性。高度同源的CRTCs蛋白家族包括3个成员：CRTC1、2和3。其中，CRTC1主要在脑组织中表达，CRTC2在肝脏组织中表达最高，CRTC3的高丰度表达部位是淋巴细胞和肺，在肌肉、肝、胰、肠等消化系统中表达量低。它们具有相似的蛋白质分子结构（以CRTC2为例，见图1），都包含N端CREB结合区（CREB binding domain，CBD）、中心调控区(regulatory domain，REG)、剪切区（splicing domain，SD）及C端转录活性区（transcription active domain，TAD）。N端CBD形成螺旋-螺旋结构与CREB的碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）区直接结合，是CRTCs家族的特征结构。CRTC2的核定位区(nuclearlocalization signal，NLS)、出核信号区（nuclear exportsignal，NES）位于中心调控区REG，其中171位丝氨酸的磷酸化状态调控CRTC2的核质定位。C端的转录活性区（transcription active domain，TAD）具有转录共激活活性。

胰岛素敏感性组织中，CREB/CRTCs通路在能量代谢调控过程中扮演了多种角色。最新研究证明CRTC2是肝糖异生途径中一个重要的转录调节共激活因子。静息条件下，CRTC2的Ser171被盐诱导激酶2（salk induced kinases 2，SIK2）持续磷酸化，与胞质蛋白14-3-3结合而被滞留在胞浆中，当cAMP升高时，被PKA磷酸化的SIK2磷酸酶活性降低，导致CRTC2磷酸化水平急剧下降并脱离14-3-3蛋白，随后进入细胞核与停留在CRE元件上的CREB结合，同时CRTC2的Lys628被CBP/P300乙酰化，CRTC2再招募来TAF4，此时以CBP/P300-CREB/CRTC2-TAF4为主要成分的蛋白复合体有力地上调CRE的靶基因转录，快速上调肝糖异生相关基因的转录。空腹或给予胰高血糖素时肝实质细胞内发生以上生理过程。进食后，一方面，胰岛素通过蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）使SIK2去磷酸化，激酶活性增强的SIK2使CRTC2重新磷酸化，与14-3-3蛋白稳定结合而停留在核外；另一方面，核内的CRTC2被SIRT1去乙酰化后随即被外壳蛋白Ⅰ（coat protein I，COPI）介导的泛素化所降解，从而迅速削弱CREB下游基因的转录。活体内CRTC2的敲减显著降低了肝产糖量。最近研究还表明，胞质型CRTC2通过与外壳蛋白Ⅱ（coatprotein II，COPII）复合体结合,从而调控固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein1，SREBP1）前体囊泡有序转运和SREBP1的逐步成熟，进而调节肝脏脂质合成，CRTC2敲除小鼠因SREBP1的成熟水平失控而导致肝脏脂质累积。因此，CRTC2的磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰水平，以及细胞不同定位不但在肝糖异生调控中发挥重要作用，而且有可能在一定程度上整合了肝脏的糖异生以及脂质合成，保持机体的糖脂代谢稳态。此外，CRTC2还整合了糖皮质激素信号通路。最近的研究证实CRTC2通过结合GR，增强肝脏糖异生关键限速酶的转录活性，提高肝脏糖异生效率，揭示了全新的CRTC2调控肝糖异生的作用机制。在实体器官移植病人中，CRTC2基因多样性是诱发器官移植术后代谢综合征的高风险因素，因此，CRTC2的遗传背景有可能成为器官移植术后代谢性疾病的一个诊断指标。多项独立的研究成果证实了cAMP-PKA-CREB/CRTC2在肝糖异生信号转导中的核心地位，肝脏CRTC2因整合多种激素（胰高血糖素、胰岛素、糖皮质激素）、代谢中间产物（葡萄糖、脂类及AMP），以及多种调控性蛋白质333536对肝糖异生进行转录调控，而成为血糖控制的一个全新靶点。

神经系统通过下丘脑和植物神经系统调节不同激素的分泌，实现对肝糖异生的调控。当下丘脑腹内侧核兴奋时，一方面通过交感神经促进肾上腺髓质分泌肾上腺素、促进胰岛α细胞分泌胰高血糖素；另一方面直接作用于肝脏，促进糖原分解和糖异生，总体升高机体血糖。相反，当下丘脑外侧核兴奋时，迷走神经被兴奋，进而促进胰岛β细胞分泌胰岛素、促进肝糖原合成，使机体血糖降低。神经系统维持机体中枢节律，并同步肝脏等外周组织节律，使机体代谢适应环境变化。目前已经证实打破神经系统兴奋周期的现代生活方式如熬夜、长期夜班等是导致代谢紊乱的一个高风险因素。研究结果逐渐揭示这一现象的分子机制——外周生物钟成分调控代谢平衡。研究发现，抑制性节律因子CRY1能直接与Gsα以及GR结合，进而节律性地对肝糖异生进行调控，响应机体对血糖的需求。作为CRE元件的靶基因之一，核心节律因子芳香烃受体核转运样蛋白1（aryl hydrocarbon receptornuclear translocator-likeprotein 1，ARNTL，也称BMAL1）既是维持肝脏组织外周节律振荡的分子基础，也是肝脏代谢状态的感应器。饥饿时，胰高血糖素诱导PKA-CREB/CRTC2-CRE通路开放，提高BMAL1的转录水平提高；进食后，胰岛素信号介导BMAL1的磷酸化以及细胞浆定位，胞质BMAL1进而参与核糖体蛋白质翻译过程，使细胞的蛋白质合成与生理需求相互吻合。因此，CREB/CRTC2的调节剂可以通过调控节律因子BMAL1的表达，对肝脏代谢进行间接调控，也有可能被应用于调整外周节律紊乱。神经系统、外周节律和肝糖异生的调节机制的阐明，将为靶向肝糖异生的降血糖药物研发提供更多新颖的靶点，为开发多功能的血糖调节剂提供更多可能。

2基于肝糖异生的降血糖药物

特异性靶向抑制肝糖异生途径是降血糖药物研发的一个重要方向。以肝糖异生的调控机制为基础，有以下几种类型调节剂：受体拮抗剂/激动剂/治疗性抗体；磷酸酶激动剂/抑制剂；转录因子调节剂；产糖限速酶抑制剂。

2.1靶向受体

利用受体拮抗剂、激动剂以及抗体调控糖异生相关受体的活性是新型降血糖药物研发的热点。GCGR信号通路由PKA介导并快速启动糖异生限速酶的转录，因此GCGR拮抗剂具有特异性降低空腹血糖的潜力。目前研究发现GCGR小分子拮抗剂，如NNC92-1687（1）、Bay-27-9955（2）和三取代脲（3），具有很好的降血糖效果（IC50分别为20、70 ~ 200、3.2 ~210μmol · L-1）。最近还发现一类可口服的新型GCGR拮抗剂环状胍（4），其能在糖尿病小鼠体内有效抵抗胰高血糖素诱导的血糖升高。同时，胰高血糖素受体单克隆抗体兼顾特异、高效和低副作用而具备应用前景。

胰岛素受体激动剂通过结合胰岛素受体，提高各组织的胰岛素信号敏感性，抑制肝脏糖异生过程。目前上市的各种治疗用胰岛素（如甘精胰岛素、地特胰岛素、门冬胰岛素和赖谷胰岛素等），属于胰岛素受体激动剂，适用于不同治疗途径、患者类型和使用时间。尽管胰岛素能高效降糖且适用人群广，但也有不易保存、易降解以及侵入式给药方式等自身缺陷，因此小分子激动剂成为另一个研发热点，目前小分子DB03909，作为促进胰岛素分泌的P2Y受体的激动剂已进入开发阶段。小分子4548-G05（6）选择性结合胰岛素受体，而不激活结构相似的胰岛素样生长因子受体（insulinlikegrowth factor receptor，IGFR），具有潜在的开发价值。来源于印度、斯里兰卡热带药用植物Gymnemasylvestre长期被用于降糖和减肥，研究者发现其主要成分（gymnemic acids，gymnemoside B以及GS4等）具有胰岛素类似活性，结合化合物亲和特性以及分子对接技术对原药进行改造，得到亲和性更强、毒性更低的类似物（7a~7d）。为了发现新的胰岛素受体结合小分子，研究人员以胰岛素与胰岛素受体共晶晶体的NMR数据为构效分析的起点，利用胰岛素双链中的3个关键氨基酸（ValB12、PheB24和TyrB26，B代表胰岛素B链）之间的空间关系，在已知的化合物数据库中搜索，发现了弱激动剂thymolphthalein（8）及其类似物具有竞争性结合胰岛素受体、激活胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）、启动胰岛素通路的作用，这些胰岛素受体的小分子激动剂的进一步开发将会提供更多的胰岛素替代疗法。

胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体激动剂与胰岛素联合使用可有效降低2型糖尿病患者的血糖水平，具有广泛应用于临床的潜力。GLP-1受体激动剂通过激活GLP-1受体信号通路，刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，促进β细胞的增殖，故GLP-1受体激动剂具有抑制亢进的肝糖异生的作用。目前临床实验证实GLP-1激动剂联合胰岛素治疗2型糖尿病优于胰岛素单独治疗，并且，GLP-1激动剂可以平稳控制1型糖尿病患者血糖，避免胰岛素剂量不准确导致的低血糖。

2.2磷酸酶调节剂

磷酸酶抑制剂通过调节关键信号分子的磷酸化状态进而调节肝糖异生过程，因此检测化合物或多肽对磷酸酶功能的活性是筛选药物的一个常用策略。近年来研究证实多种一线降糖药物如二甲双胍、噻唑烷二酮通过增强AMPK的磷酸化，增强CRTC2的磷酸化，抑制CRTC2入核，抑制CRTC2的转录共激活活性，从而在整体上改善高血糖症。研究者开发出一种偶联腺苷的富含精氨酸多肽，这种多肽能结合PKA催化亚基并抑制其活性，而抑制CREB磷酸化和CRTC2去磷酸化及它们的转录活性，具有抑制肝糖异生的潜在活性。研究表明小分子saponarin（9）与小檗碱berberine（10）能以AMPK为主要靶蛋白，增强CRTC2磷酸化，进而抑制CREB介导的糖异生过程。然而，在该机制被揭示以前，这些化合物已经被广泛地应用于包括免疫调节、肿瘤治疗以及代谢调控等多个方面。因此，充分了解一线降糖药物的药理作用机制，深入发掘传统药物的活性成分，不但有利于开发针对AMPK、PKA、PKC等关键信号分子的磷酸酶调节剂，而且能为设计新型糖异生抑制剂提供理论基础。

2.3转录因子调节剂

CREB是代谢调控的重要转录因子。根据CREB-染色质免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitation，CHIP）分析，约有2 000个基因启动子区含有CRE元件。基因功能聚类分析显示，CREB的这些靶基因大多参与代谢调控。试验证实CREB缺失可显著降低肥胖及糖尿病模型小鼠的血糖及血脂水平，因此，CREB的抑制剂具有调节血糖、增进胰岛素敏感性的潜力。通过结构分析，发现人工设计的小分子666-15（11）可以通过结合CREB进而抑制CREB的靶基因转录。目前证实一线降糖药物二甲双胍和噻唑烷二酮，以及传统中药成分小檗碱等药物能通过调控CRTC2的磷酸化，抑制CREB介导的肝糖异生关键酶基因的转录活性，进而抑制肝糖异生过程，发挥降血糖的作用。这些老药的全新作用机制对于设计类似药物有重要的启示。

CBP/P300是CREB的共激活因子，其能帮助转录复合体招募RNA聚合酶Ⅱ，同时使染色质组氨酸乙酰化以促进DNA双链解旋，加快CREB靶基因转录的启动。研究证明CBP/P300的小分子抑制剂naphthol ASTRphosphate（NASTRp，12）具有治疗肺癌的潜力；CBP/P300的乙酰化活性抑制剂在治疗消化道间质肿瘤中具有显著效果。作为CREB的重要共激活因子，CBP/P300直接参与了CREB对肝糖异生等生理过程的调控，故CBP/P300的小分子调节剂可能同样适用于代谢性疾病治疗药物的开发。

2.4糖异生限速酶抑制剂

筛选和设计糖异生限速酶的抑制剂是研发新型降糖药物的另一个热点。G6Pase负责2条肝糖生成途径（糖原裂解和糖异生）的最后一步反应，是肝糖生成的最后一步关键酶。目前已发现天然产物蒽醌的类似物mumbaistatin（13）是G6Pase转位酶G6PT1的高效抑制剂，而氢吡啶噻吩化合物（14）是G6Pase催化亚基的酶活抑制剂（IC50=350 nmol· L-1）。研究证明，MB06322（CS-917，15）通过靶向抑制果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase，FBP）的活性，降低自发性糖尿病大鼠（Goto Kakizakirat）的进食后高血糖。研究者通过比较FBP天然底物的结构，设计并合成了能够特异性结合FBP的小分子抑制剂（16），其IC50接近天然抑制剂腺苷酸（adenosine monophospate，AMP）。根据天然底物与PEPCK的构象，研究人员对PEPCK底物oxaloaetate（OAA）等进行改造，所得小分子能竞争性结合胞质型PEPCK，并抑制该酶催化形成磷酸烯醇式丙酮酸的酶活性，进而降低肝糖异生效能。

3结语

逐渐解析的2型糖尿病分子机制有可能为2型糖尿病的诊断、新型药物的研发提供新的思路和方案，为糖尿病的精确治疗奠定基础。目前已有部分代谢调控的基础研究转化为治疗方案，如分泌型脂肪酸结合蛋白AP2的治疗性单克隆抗体经过开发，应用于提高2型糖尿病患者的胰岛素敏感性，调节整体代谢。肝脏是人体糖、脂、药物代谢的重要器官，更是人体最大的产糖工厂，以肝糖异生机制为靶点开发新型降血糖药物已是糖尿病转化医学的一个重要组成部分。

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