解密！大数据分析、网络药理学告诉你中医药治疗痛风的用药规律和作用机制
引言
痛风是因血尿酸水平过高导致单钠尿酸盐结晶沉积在关节内而引发的一种异质性代谢性疾病，临床可见关节红肿热痛、痛风石，严重者可出现关节破坏、畸形，甚至肾功能损害。目前治疗痛风的常用西药主要有非甾体抗炎药、秋水仙碱、苯溴马隆、非布司他等，这些药物均有一定程度的肝肾功能损伤风险，且单一的西药治疗难以达到根治效果，联合用药又会增加不良反应。
中医药在辨证论治的基础上遣方用药，治疗痛风具有独特的优势。但中医学流派较多，无统一的用药标准，且多为自拟处方，缺乏现代药理学及大样本用药规律研究支持，药物作用机制亦不十分明确。近年来，上海市光华中西医结合医院何东仪教授团队牵头单位的10个地区（省、自治区、直辖市）的22家医院，收集了其中治疗痛风的中药处方资料，借助数据挖掘技术进行信息挖掘和分析，同时采用现代网络药理学方法从分子作用层面阐释其药理机制，期望为中医药临床治疗痛风提供理论依据。原文已发表于《上海中医药杂志》2023年第4期。
通信作者
何东仪，一级主任医师、教授、博士生导师、博士后合作导师，享受国务院特殊津贴，上海市名中医，上海市领军人才。任上海市光华中西医结合医院副院长、中西医结合关节炎研究所副所长。兼任中国中西医结合学会风湿病专业委员会候任主任委员、中华中医药学会风湿病分会副主任委员、中华中医药学会风湿病防治创新共同体副主席、上海市医学会风湿病分会主任委员、上海市中西医结合学会风湿病分会主任委员、上海市中医药学会风湿病分会常务副主任委员等。
近五年以第一负责人承担科研项目8项，其中国家级课题3项，累计获科研经费总计845.04万元。牵头或参与多项类风湿关节炎的临床研究项目。牵头我国首部《强直性脊柱炎中西医结合诊治指南》编写工作，参与《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》《中国类风湿关节炎患者报告的临床结局量表专家共识》《类风湿关节炎患者实践指南》《雷公藤多苷/雷公藤片治疗类风湿关节炎用药指南》等12部风湿免疫相关疾病指南。在国内外核心期刊发表学术论文111篇，其中SCI 源期刊论文61篇，总影响因子316.9，综合学术影响力H指数达31。主编或副主编论著3部，获得发明专利1项。先后获中国中西医结合科技奖三等奖、上海市科技进步奖一等奖、上海中医药科技奖三等奖、上海市中西医结合科技奖三等奖等奖项。
1.资料与方法
1.1 数据挖掘
1.1.1 中药处方来源
本研究收集的中药处方均来自以上海市光华中西医结合医院为牵头单位的10个地区（省、自治区、直辖市）的22家医院，患者就诊时间限定为2015年1月至2021年12月。
1.1.2 纳入标准
①患者符合相关文献［6］中痛风的诊断标准；②中药处方及随访数据完整；③多次就诊的患者仅提取初诊和末次就诊的临床数据。
1.1.3 排除标准
①中医辨证、中药处方等临床信息不全的资料；②患者合并有其他关节疾病的资料。
1.1.4 信息提取与规范化
提取符合标准的临床数据，提取内容包括中医证型以及中药名称、药味、药性、归经、功效等，参考《中华人民共和国药典（2020年版）：一部》［7］和《中药学》［8］中的有关内容规范中药名称，如炒薏苡仁、苡米、生薏苡仁等统一为薏苡仁。借助Microsoft Excel 2019软件，采用人工双录入模式录入数据。
1.1.5 统计学方法
采用Microsoft Excel 2019软件进行中医证型和中药药味、药性、归经、功效分类的频次、频率分析，借助SPSS Modeler 18.0及SPSS Statistics 20.0软件对高频用药进行关联规则［9］和系统聚类分析［10-11］。
1.2 网络药理学
根据聚类分析结果，选取核心药方（即地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓）进行网络药理学研究。
1.2.1 中药活性成分的收集与筛选
通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）［12］、中医药整合药理学研究平台（TCMIP，http：//www.tcmip.cn）、中医药百科全书（ETCM）［13］和本草组鉴（Herb，http：//herb.ac.cn/）等多个数据库，获取中药（地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓）的有效成分，并查阅文献进行成分补充。按照口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18的标准筛选活性成分。
1.2.2 潜在靶点的预测及核心基因的筛选
借助小分子生物活性数据库（PubChem）（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［14］得到中药活性成分的Canonical SMILE结构式，然后导入SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）［15］预测活性成分的作用靶基因，并用UniProt蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org/）［16］对获得的基因名称进行标准化处理。
通过人类基因综合数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org/）［17］、药物靶标数据库（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd）［18］、DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）［19］、人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.org/）［20］以及药物遗传学和药物基因组学知识库（PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org/）［21］检索与痛风相关的疾病基因，限定物种为人类。
将中药基因与疾病基因进行交集分析，得到二者的共同基因，然后借助Cytoscape 3.7.2软件中的CytoHubba插件对共同基因进行分析，并通过5种计算方法（Stress、Radiality、MNC、EPC、BottleNeck）进行分析，每种计算结果只显示排名前10的基因，进行交集分析后获得中药治疗痛风的核心基因。
1.2.3 通路分析
将靶基因导入Cytoscape 3.7.2软件，利用ClueGO插件进行基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库分析。以P≤0.01为标准对结果进行筛选，展示排名前10的生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）条目。然后分析KEGG通路，并将排名前10的通路进行可视化展示。
1.2.4 药物-成分-基因-信号通路网络的构建与分析
使用Cytoscape 3.7.2软件进行关联分析，构建药物-成分-基因-信号通路网络，并对排名前10位的中药成分进行分析和展示。
2.结果
2.1 数据挖掘情况
2.1.1 一般情况
本研究共收集2688例痛风患者的临床数据，其中男性2513例、女性175例，男性平均年龄（52.32±15.51）岁，女性平均年龄（67.03±12.88）岁。共获得中药处方659首，进行后续的数据整理和分析。
2.1.2 用药频次分析
本研究收集的659首处方共涉及中药266味，总使用频次为9 143次。其中使用频率≥1%的中药有土茯苓、薏苡仁、川牛膝、苍术、黄柏、秦艽、独活和威灵仙等，共36味，占总频次的70.08%，为高频用药。见表1。
表1 中药使用频次分析（频率≥1%）
注：中药总使用频次为9143次。
2.1.3 药味、药性、归经及功效分析
本研究涉及的266味中药的药味以甘、苦、辛为主，累计频率为81.71%；寒、平、温药性排前3位，累计频率为71.06%；主要归于肝、肺、胃、脾、肾经，累计频率为76.13%；功效以清热、补虚、利水渗湿、活血化瘀和祛风湿为主。见表2、表3、表4、表5。
表2 中药药味分析
表3 中药药性分析
表4 中药归经分析
表5 中药功效分析
2.1.4 中药关联规则分析
运用SPSS Modeler 18.0软件对266味中药进行关联规则分析，设置弱链接上限为60，强链接下限为100，结果得到强链接（频数≥100）药物组合120个，其中包含中药22味，见图1。按频数由大到小排列，排名前20位的药物组合主要为土茯苓-薏苡仁、川牛膝-薏苡仁、苍术-黄柏、川牛膝-土茯苓和秦艽-土茯苓等，见表6。
图1 药物关联网络图
表6 治疗痛风的常用药物组合（前20位）
采用Apriori建模进一步分析266味药物之间的配伍关系，设置支持度为20%，置信度为80%，最大前项数为2。结果得到144个药物关联规则组合，共包含22味中药，这些中药与前面分析得到的22味中药相同。按照支持度百分比排名，排名前20的关联规则组合主要是薏苡仁-川牛膝、黄柏-苍术、薏苡仁-苍术、苍术-黄柏等（见表7），且提升度均>1，该关联规则被认为具有正向关联。
表7 中药关联规则分析
由此可以看出，在治疗痛风的中药处方中，强链接药物组合与Apriori建模分析后的药物关联规则组合之间存在关联。
2.1.5 中药聚类分析
将上文涉及的中药进行交集分析，最终得到高频率使用的中药22味，即鳖甲、苍术、赤芍、川牛膝、地龙、独活、防风、防己、葛根、黄柏、络石藤、绵萆薢、牡丹皮、秦艽、忍冬藤、山茱萸、石膏、土茯苓、威灵仙、细辛、薏苡仁和知母。采用SPSS Statistics 20.0软件对22味中药进行系统聚类分析，生成树状聚类图。见图2。
图2 中药树状聚类图
根据中医理论及临床实际，最终选取距离为15，此时可将药物聚合为4类。Ⅰ：地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓；Ⅱ：苍术、黄柏、知母、石膏、忍冬藤、防己、细辛、络石藤；Ⅲ：独活、防风、山茱萸、葛根、赤芍、牡丹皮、威灵仙；Ⅳ：绵萆薢。结合高频率中药分析以及关联规则结果，发现地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓无论是单味药还是药物间的互相组合，其出现均非常频繁。因此我们推测，聚类分析结果中Ⅰ类的中药组合可能是治疗痛风的核心药方。
2.2 网络药理学分析情况
根据聚类分析结果，最终选取核心药方（即地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓）进行网络药理学研究。
2.2.1 中药活性成分筛选与靶基因预测情况
本研究共获得中药有效成分64个，作用基因729个。
2.2.2 痛风基因获取及核心基因的筛选情况
通过多个数据库检索，共获得痛风疾病基因2 488个，将中药基因与疾病基因进行交集分析后得到二者的共同基因306个，见图3。借助Cytoscape 3.7.2软件中的CytoHubba插件对共同基因进行分析，最终获得5个核心基因，即肿瘤坏死因子基因（TNF）、丝氨酸/苏氨酸激酶1基因（AKT1）、白介素-6基因（IL-6）、肿瘤蛋白P53基因（TP53）、鸡肉瘤病毒基因（SRC），见图4。这些基因可能是中药治疗痛风的核心作用基因。
图3 中药和疾病的共同基因
图4 核心基因筛选
2.2.3 GO富集和KEGG通路分析
GO结果显示，BP包括肽-酪氨酸磷酸化生物过程，CC包括细胞膜微结构域结构，MF涉及蛋白酪氨酸激酶活性功能，见图5。KEGG主要涉及凋亡、坏死性凋亡和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路等途径，见图6、图7。上述提示药物组合地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓可能通过上述生物进程和信号通路治疗痛风。
图5 基因本体（GO）富集分析结果
注：BP为生物过程，CC为细胞成分，MF为分子功能。
图6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析结果
图7 信号通路展示（前10位）
2.2.4 药物-成分-基因-信号通路网络构建与分析
将6味中药、64个中药成分、306个基因和排名前10的信号通路通过Cytoscape 3.7.2软件进行关联分析，结果见图8。对排名前10位的中药成分进行分析和展示，结果显示中药成分黄芩素、汉黄芩素、槲皮素、山柰酚可能是新药物组合治疗痛风的关键成分，这些成分可能通过TNF、AKT1、IL-6、SRC关键基因来调控凋亡、坏死性凋亡和TGF-β信号通路，见表8。
图8 药物-成分-基因-信号通路网络
表8 中药有效成分治疗痛风的可能机制
注：—表示没有涉及到核心基因。TNF为肿瘤坏死因子基因，SRC为鸡肉瘤病毒基因，AKT1为丝氨酸/苏氨酸激酶1基因，IL-6为白介素-6基因。
3.讨论
痛风作为一种常见的晶体沉积性疾病，可以导致关节炎症，是男性关节炎最常见的病因。目前痛风的治疗原则包括急性期的抗炎治疗以及缓解期的降尿酸药物治疗，相关药物不良反应较多，长期疗效亦十分有限。中医药治疗痛风历史悠久、疗效确切，临床运用广泛。
本研究结果显示，临床治疗痛风的常用中药有土茯苓、薏苡仁、川牛膝、苍术、黄柏等，主要是清热药、补虚药、利水渗湿药、活血化瘀药和祛风湿药，常用的药物组合有土茯苓-薏苡仁、苍术-黄柏等。聚类后的药方主要以清热解毒利湿和活血化瘀通络为主要功效，如Ⅰ类药方为地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓，其中秦艽、薏苡仁清热利水渗湿，川牛膝、地龙活血化瘀、通行经络，土茯苓解毒、除湿、通利关节。可见，中医临床治疗痛风侧重解毒清热利湿、通络活血，体现了寒者热之，热者寒之和通则不痛的中医思想，与痛风湿、热、痰、瘀的病机特点一致［22］。研究［23-24］表明，土茯苓可以促进尿酸盐的排泄、降低尿酸水平，黄柏则能够抑制炎症反应，并起到止痛作用。
在数据挖掘的基础上进行网络药理学分析，结果显示，地龙、鳖甲、秦艽、川牛膝、薏苡仁、土茯苓共含有64个有效成分，其中黄芩素、汉黄芩素、槲皮素、山柰酚等与疾病关联密切，推测这些可能是治疗痛风的关键成分。黄芩素、汉黄芩素具有抑制炎症反应、抑制骨质退化及破坏、改善血液循环的作用，可用于多种炎症性疾病的治疗［25-26］。汉黄芩素对环氧化酶-2（COX-2）和前列腺素（PG）E2具有抑制作用，亦可以通过调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）来阻碍细胞凋亡；此外，汉黄芩素还能够调节丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB（MAPK/NF-κB）信号通路，诱导抗氧化应激表达，进而发挥抗氧化作用。［27-30］槲皮素是一种广泛存在于多种植物中的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化和诱导凋亡等活性。研究［31-32］证实，槲皮素能够显著抑制急性痛风性关节炎（GA）大鼠的踝关节肿胀度和炎症因子表达，并与剂量呈正相关。山柰酚属于黄酮类化合物，具有抗癌、抗菌、抗氧化、抗炎等多种功效，并可通过调节肠道菌群及微生物的新陈代谢来改善关节炎的症状，用于治疗许多急、慢性炎症引起的疾病［33］。通过对上述关键成分进行基因预测，我们推测这些成分可能是通过作用于TNF、AKT1、IL-6、SRC基因而对痛风发挥治疗作用。
TNF是一个被广泛研究的基因，具有多种生物学活性，作为重要的炎症因子，其可以诱导IL-6表达、参与GA骨质破坏，同时还能够直接作用于血管内皮细胞，改变细胞通透性，从而造成细胞损害［34］。IL-6能够促进淋巴细胞活化并调节炎症相关的急性期反应，刺激炎症细胞聚集，加速合成炎症介质，从而介导炎症和免疫反应［35-36］。Dai等［37］建立了单钠尿酸盐诱导的急性GA大鼠模型，发现调节性T细胞（Tregs）/辅助性T 细胞17（Th17）失衡可能参与了GA的发病机制，IL-6则是决定Tregs/Th17平衡的关键因素。AKT1被认为是治疗痛风的核心基因。研究［38］表明，与对照组相比，AKT1基因敲除的小鼠关节水肿明显减少。研究［39］还发现，痛风患者中性粒细胞发生的炎症依赖于蛋白酪氨酸激酶（SRC）家族介导单钠尿酸盐晶体诱导的白介素-8（IL-8）表达，SRC抑制剂对IL-8具有很强的抑制作用，这种抑制作用主要是通过抑制单钠尿酸盐晶体诱导的细胞外信号调节激酶（ERK）1/2和重组人NF-kB抑制物alpha（IkBa）的磷酸化，从而抑制IkappaB激酶（IKK）的激活，以及NF-κB与IL-8启动子的结合来实现的。
KEGG分析主要涉及凋亡、坏死性凋亡和TGF-β信号通路。抑制炎症的经典机制是凋亡细胞的清除和非炎症性吞噬［40］。在GA中，这种炎症反应与巨噬细胞清除凋亡的中性粒细胞有关。作为受体，谷氨酰转移酶2（TG2）在体内能够促进巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞，TG2不足会使中性粒细胞募集和单钠尿酸盐晶体驱动，从而导致炎症反应发生［41-42］。巨噬细胞清除凋亡细胞与TGF-β1密切相关，研究［43-44］发现，痛风患者关节滑液中存在大量TGF-β1，当体内TGF-β1产生受损时，GA的发作更为剧烈，TGF-β1可以促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞，从而控制炎症反应。适应性免疫应答在痛风治疗中亦有一定的作用，许多免疫和非免疫细胞都可以产生TGF-β，而TGF-β具有多效性免疫特点，可以通过影响T细胞分泌的因子和细胞表面受体而抑制适应性免疫反应［45］。因此抑制TGF-β信号转导将成为调节适应性免疫应答的一个新方法，在一定程度上也能对痛风起到治疗作用。本研究中，基因还富集于Hedgehog信号通路和钙信号通路等，但有关这些通路对痛风作用机制的研究很少。
综上，本研究为一项关于痛风的多地域、多中心、大样本研究，虽然选用的数据存在一定的不完整性，但还是比较客观、真实地反映了目前中医药治疗痛风的临床用药情况。在此基础上运用网络药理学方法，从临床实践到基础研究，推测黄芩素、汉黄芩素、槲皮素、山柰酚可能是中药治疗痛风的关键成分，可能通过TNF、AKT1、IL-6等基因来调控凋亡、坏死性凋亡和TGF-β等炎症相关通路对痛风发挥治疗作用。网络药理学方法预测的基因和通路虽然为治疗痛风提供了新的研究方向，但仍需要进一步用实验验证。
【引用本文】
姜平，吴心瑶，杜星辰，何东仪，等. 基于数据挖掘、网络药理学的中医药治疗痛风遣方用药规律和作用机制[J].上海中医药杂志，2023，57(4):72-82.
JIANG P, WU X Y, DU X C, HE D Y, et al. Data mining and network pharmacology：prescription formulation rules and mechanism of traditional Chinese medicine for gout [J].Shanghai J Tradit Chin Med, 2023, 57(4):72-82.
END
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