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史上最全：盘点ctDNA在胰腺癌“精确肿瘤手术”中的应用和问题

admin5天前皮肤科1

来源：小桔灯网

作者：动力彩虹🌈

胰腺癌（PDAC）是全球第七大癌症相关死亡原因，2020年有46603人死亡，5年生存率仅为9%。PDAC是一个令人担忧的健康问题，其发病率和死亡率不断上升，预计到2025年将成为欧洲男性和女性癌症死亡的第三大原因，仅次于肺癌和结直肠癌。PDAC的医疗管理仍然具有挑战性，因为80–90%的患者被诊断为处于不可切除阶段。在可切除的PDAC中，手术仍然是治疗的基石，而近年来，由于肿瘤外科治疗结合了全身治疗、多种化疗方案和合理的手术方法，取得了重大进展。然而，生存率仍然令人失望，切除患者的中位5年生存率仅为20–30%，而用辅助剂mFOLFIRINOX治疗的切除PDAC的3年无复发生存率（RFS）低于40%。为了改善PDAC的预后，在进行新的治疗的同时，必须面对几个挑战，包括识别新的生物标志物，以便早期检测，预测复发和治疗反应。即使抗原19.9（CA19.9）是最有效的标记物，它也存在一些局限性。

CA19.9评估可能会导致胆汁淤积症（经常出现在胰头PDAC中）、糖尿病（可由PDAC诱发）、肝硬化、慢性胰腺炎和其他胃肠道癌症患者经常出现假阳性结果。假阴性也代表了一个严重的局限性，即5–10%的高加索人群具有Lewis-null血型。

尽管如此，CA19.9有助于确定诊断时的预后。CA19.9诊断时<200 UI/mL与更好的可切除性相关，高于1000 UI/mL时提示转移性疾病。此外，术前CA19.9正常和术后CA19.9阴性表示切除术后预后良好，生存期延长。考虑到上述情况，随着诊断、预后和预测性组织生物标志物的兴起，分子生物学在肿瘤学中的地位越来越重要。转化研究旨在研究和开发血浆替代物，以替代传统的基于血液的蛋白质生物标记物，也被称为液体活检，如循环肿瘤细胞（CTC）、无细胞循环肿瘤DNA（ctDNA）和循环微RNA。

近日，来自于法国和意大利的研究团队在British Journal of Cancer杂志上发表了一篇题为Circulating tumour DNA: a challenging innovation to develop precision onco-surgery in pancreatic adenocarcinoma 的综述文章，这篇综述探讨了ctDNA作为可切除PDAC的筛查、诊断、预后和预测性生物标志物的当前知识和最新进展，以及向精确肿瘤手术发展所必须克服的技术和分析挑战.

图片来源：British Journal of Cancer

主要内容

PDAC中的分子突变机制

KRAS癌基因的激活突变代表90%PDAC的起始事件。这种单核苷酸突变替换主要涉及密码子12（外显子2）（G12D、G12V或G12R），也可能发生在密码子11、13或61上，但频率较低。KRAS（KRASmut）的突变改变了RAS的内在活性，并阻止GTP依赖GTPase转化为GDP（活性到非活性形式）。因此，该蛋白永久激活下游信号通路，从而维持增殖过程和细胞存活。在常见的PDAC前体病变，如胰腺上皮内瘤变（PanINs）中检测到KRASmut，证实了这种早期突变在肿瘤发生中的发生。与PDAC相关的其他体细胞分子改变涉及TP53、CDKN2A、SMAD4、STK11和ERBB4。总的来说，不到25%的PDAC含有可操作的分子改变，有临床证据表明靶向治疗的预期益处。

这些变异反映了广泛的肿瘤间异质性。基于组织的PDAC分子分类面临了几个挑战，尤其是缺乏切除的肿瘤组织标本和大多数标本的低肿瘤细胞数。如果血液中检测到的突变与相应肿瘤的一致，微创取样也可以为PDAC患者的纵向分子分析提供新的机会，以开发综合肿瘤监测策略。

胰腺癌的遗传进展模型

图片来源：British Journal of Cancer

PDAC中的CtDNA样本和诊断工具

1983年，Shapiro等人首次描述了胰腺癌患者外周血循环中高水平的无细胞DNA（cfDNA）。循环肿瘤DNA（ctDNA）来源似乎是一个复杂的现象，一些可能来源肿瘤的坏死、凋亡，另一些可能由活跃的肿瘤分泌。由于ctDNA在总cfDNA中可能会被稀释，因此鉴定ctDNA可能很困难。尤其是在可切除患者的早期肿瘤阶段，ctDNA可能占总cfDNA的<1%，其检测可能需要高度敏感的方法。最常见的技术分为两类。有针对性的技术，例如数字PCR（dPCR），其中最先进的技术是数字滴PCR（ddPCR），一种纳升大小的油包水乳化液滴技术。第二类是非靶向技术，如下一代测序（NGS）。ddPCR更快、更便宜，并且不需要复杂的生物信息学分析。无论采用何种技术，ctDNA鉴定的主要目标是KRASmut，可在26–73%的PDAC各期患者中检测到，而且与不良预后有关。这些与PDAC活检形成对比，在PDAC活检中，KRASmut几乎是100%。这种差异可能强调了技术和生物学上的局限性，但也可能反映了同一肿瘤内的功能异质性，以及一部分肿瘤细胞不会在血流中释放突变的KRAS ctDNA。

虽然已经在技术方面做出了努力，但优化收集样本条件仍然是一个先决条件。目前，市场上可以买到标准乙二胺四乙酸（EDTA）和一些不同类型的专门设计的用于无细胞核酸保存的收集管。在后者中，血样可在采集后7天内储存、运输，和进行血浆处理（根据制造商的说明）。然而，具体的cfDNA指南建议，在血浆分离和储存之前，在室温下EDTA的保存时间最好不超过2-4小时，和在收集管内最多保存3天。

CTDNA作为筛选和早期检测标记

尽管胰腺癌分子生物学方面的知识越来越多，但迄今为止还没有经过验证的筛查项目。由于大多数早期PDAC患者无症状，建立全面筛查计划是实现早期发现的唯一途径。遗传性胰腺癌家族以及胰腺囊性肿瘤（PCN）代表了一组随着时间的推移具有可变恶性潜能的疾病，并对早期发现的大机会窗模型做出了完美的反应。对这些高危人群进行筛查需要进行高度可靠的检测，这主要是因为筛查结果的负预测值以及这些家庭承受的精神负担。有必要更好地识别具有恶性潜能的囊性病变，以避免不必要的手术，从而降低发病率和死亡率。作为一种侵入性较小的方法，Berger等人研究了PCNs患者的cfDNA。他们证明在导管内乳头状粘液性肿瘤患者中可检测到cfDNA GNAS突变（71.4%），此外，他们还评估了cfDNA中和配对切除的组织标本中GNAS突变的一致性。未来需要根据cfDNA结果对手术适应症进行大规模评估，以实现一个强大的PCNs筛查工具。

血清标志物的组合

因为CA19.9的局限性和其他循环蛋白，非侵入性生物标记物开发的最新方法集中于甲基化标记物、ctDNA突变和蛋白质生物标记物的组合，以检测早期疾病。Fujimoto等人最近评估了甲基化RUNX3基因与CA19.9联合使用检测PDAC的临床表现。在I期疾病患者中，CA19.9和甲基化RUNX3为55.6%，但联合试验的Se为77.8%（所有阶段为85.5%）。相反，Majumder等人使用13个甲基化DNA标记结合CA19-9，在所有阶段显示了高准确率的PDAC检测（92%的Se和Sp）。相比之下，Shinjo等人使用了一种简单的ctDNA样本方法，该方法需要三天时间，只需10 ng DNA，以及一组五个甲基化基因（ADMATS2、HOX、PCDH10、SEMA3和SPSB4）与CA19.9相结合，结果显示Se为68%，Sp为86%。

此外，确定原始组织是另一个问题。由于同一基因突变可能根据细胞类型导致多个肿瘤，仅基于基因组分析的液体活检通常无法确定原发肿瘤的解剖位置。Cohen等人开发了一种名为CancerSEEK的血液检测算法，用于检测包括PDAC在内的五种常见癌症。CancerSEEK应用于1005名非转移性临床检测癌症患者（93名PDAC）和812名健康人。他们利用自己设计的61个扩增子组（包括PIK3CA、APC、EGFR、BRAF、CDKN2A、KRAS和TP53），开发了一项包含8种血液蛋白（包括CEA、CA125和CA19.9）和16种基因的联合检测。这些经过优化的69种生物标记物的综合功效使PDAC的Se为72%（69–98%用于检测所有五种癌症），同时保持高99%的Sp。在这一领域，这是最重要的研究之一，表明了将不同的生物标记物结合在癌症早期检测中的重要性，这是减少癌症死亡的关键。因此，考虑到胰腺癌的发病率与其他癌症类型相比相对较低，联合使用标记物可能是在普通人群中识别高危人群的最有希望的策略。

CtDNA在术前诊断时的作用

只有20%的患者可能是治疗性肿瘤切除的候选者。局部受累和治疗性可切除性由影像学决定，主要是通过CT扫描。然而据报道，15-25%的切除患者出现早期复发（<6个月)。这证明了目前的图像引导分期方法和过度手术方法对微转移性疾病的评估是不完善的。在包括155例PDAC在内的410例恶性肿瘤患者中，Bettegowda等人检测到48%的局部疾病患者的ctDNA，并将可检测患者的比例和ctDNA水平与肿瘤分期相关联。在一项针对51名患者的研究中，Sausen等人首先评估了ctDNA在可切除PDAC患者中的预后价值。通过针对KRASmut的ddPCR方法，他们在诊断时在22名患者（43%）的血浆中发现了可检测的ctDNA，Sp>99.9%。可检测到ctDNA的患者比无法检测到改变的患者更容易复发，强调了ctDNA作为微转移疾病生物标志物的作用。

虽然也有研究团队报告了不一致的结果，但总的来说，这些结果支持将ctDNA作为分层标记物来监测诱导治疗反应，以及作为补充影像学或临床症状的适当干预的标记物。

CtDNA在术后的作用

CtDNA含有与肿瘤相关的突变，可用于后续研究。术后ctDNA监测可能有助于临床医生发现高危患者并治疗早期复发。在一组135名PDAC各期患者中，其中31人接受了治疗性切除术。其中，6例（19%）术后可检测到ctDNA，因此DFS（4.6个月对17.6个月）和OS（19.3个月对32.2个月）更短，进一步加强了ctDNA作为术后早期疾病复发标志物的可能性。术后KRASmut阳性（N=11/41，27%）也被报道为DFS（5个月对15个月）和OS（17个月对未达到中值）的预后因素。最近，ctDNA监测被报道为一种强有力的随访标志物，并比CT成像（Se 90%–Sp 88%）提前3到6.5个月预测复发。然而，到目前为止，还没有证据表明这种早期检测是否可以通过早期治疗方法提高生存率。未来需要进行大规模干预性试验，以证明基于ctDNA变异性的靶向方法如何改善结果。

液体活检在PDAC患者护理和随访中的潜在应用

图片来源：British Journal of Cancer

观点和结论

作为外周血中最广泛的液体活检分析物，ctDNA已被研究用于各种临床应用。近年来，包括PDAC在内的胃肠道癌症临床试验设计中越来越多地纳入了ctDNA检测。这些试验中有许多集中在基于ctDNA的患者分层定向治疗。ctDNA的高Sp可显著帮助PDAC诊断，避免重复侵入性操作和治疗延迟。目前，其相对较低的Se阻止了其在常规临床实践中单独用于筛查和诊断。发展超敏感技术、甲基化特异性图谱、与其他血浆生物标记物结合，或与人工智能相配合，可以提高ctDNA诊断或筛查性能，并可能代表临床使用液体活组织检查的未来。正如在其他实体癌（如肺癌或前列腺癌）中开发的那样，PDAC中的多分析物方法也很有前景。结合CTC和肿瘤exosome检测，Buscail等人报告了可切除患者的100%Se和80%Sp。然而，在测试的准确性和可行性之间取得平衡仍然是一个问题。

动态胰腺临床试验（ACTRN12618000335291）根据ctDNA评估辅助策略（如果ctDNA阴性，则降低治疗水平，另一种情况下则提高化疗水平），将提供这方面的新数据。为了在未来几年中最大限度地发挥这种生物标志物的临床效用，我们必须就一致同意的方案、标准化技术和cut-off准确度值达成一致。

最后但并非最不重要的一点是，临床工作流程中的液体活检和ctDNA整合存在一些挑战，这是一个经常被忽视的关键而复杂的方面。液体活组织检查和多靶点检测需要在开发期间及其日常临床实施中投入大量时间、资源和知识。最先进的NGS机器、用于测序数据的合适云存储、用于数据分析的实验室技术人员和生物信息学家是基本投资的一部分。将液体活检纳入临床工作流程的另一个重要方面涉及对医院人员（包括病理学家、护士和医生）进行应用和解释新标记物的教育和培训。同样，将收到分析报告的医生需要接受阅读报告、解释结果并采取相应行动的培训。鉴于个性化医学在肿瘤学领域的重要发展，未来大学课程中还应教授新技术和新护理方法的教育。

综上所述，ctDNA是一种很有前途但也是一种复杂的生物标志物。尽管ctDNA的特异性似乎很好，但其目前的敏感性仍然是临床应用的一个限制。越来越多的证据表明，ctDNA是评估术后微小残留疾病的相关候选生物标志物，但也是一个强有力的独立预后生物标志物。应对未来几年确定的所有挑战将导致肿瘤学的深刻变革。针对每种临床情况准确设计的专用前瞻性试验是使用ctDNA实时评估和管理PDAC患者肿瘤演变的唯一方法。

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